ИМУНОДИАГНОСТИКА И ИМУНОТЕРАПИЯ ПРИ РЕПРОДУКТИВНИ НЕУСПЕХИ

1. ИМУНОДИАГНОСТИКАИ ИМУНОТЕРАПИЯПРИ РЕПРОДУКТИВНИ НЕУСПЕХИ Доц. д-р Емилияна Конова, д. Център за репродуктивно здраве Медицински Университет - УМБАЛ Плевен

2. Репродуктивни неуспехи Стерилитет Инфертилитет Усложнения на бременността Неуспешни IVF

3. Репродуктивни неуспехи- интердисциплинарен проблем • акушерство и гинекология • репродуктивна имунология • репродуктивна ендокринология • медицинска генетика • инфектология

4. Репродуктивна имунология • Медицинска дисциплина, произхожда от трансплантационната имунология - фетусът е ало-трансплантат, подчинен на законите на отхвърляне или приемане • Цели: изясняване имунорегулацията на: - нормалната бременност - неуспешната бременност - неуспешните фертилизации in vitro

5. Reproductive Immunology Journals in the field of Reproductive Immunology • Bulgarian Biologia et Immunologia Reproductiones - 1979 • Journal of Reproductive Immunology -1979 • American Journal of Reproductive Immunology -1982 • Assisted Reproduction • European Journal of Contraception & Reproductive Health Care • European Journal of Obstetrics & Gynecology & Reproductive Biology • Fertility & Sterility • Human Reproduction • Journal of Assisted Reproduction and Genetics • Journal of Reproductive Medicine Online • Molecular Human Reproduction • Reproduction, Fertility and Development • Biologia et immunologia reproductions - 1979-1990 and others

6. Prof. Alan BeerThe “Father of reproductive immunology”In memoriam...

7. International Symposium for Immunology of Reproduction VARNA The 9th Symposium, 2000

8. Защо бременността е успешна трансплантация? Фетус Имунна система - генетично чужд на майката Имплантация - Плацента - нахлуване на единство на ало-антигени несъвместимости

9. MALT в женския генитален тракт ваг. лигавица ектоцервикс ендоцервикс ендометриум ендосалпинкс

10. MALT в женския генитален тракт -автономна лимфоидна тъкан • АПК - резидентни МФ, Лангерханcови, дендритни клетки • IEL - CD8+T-лим. (преходна зона и ендосалпинкс) • LPL - CD4+T-лим. (преходна зона и ендосалпинкс) • IgA-съдържащиплазмоцити • NK клетки (ендометриум)

11. Ендометриални NK-клетки • Фенотип: CD3-/CD56++/CD16- • 70-80% от ендометриалните лимфоцити през секреторната фаза (mid) - max брой тогава! (пери-имплантационен период, Р-зависимост) • Експресират IL-2 Rи се активират от IL-2 (Th1) до LAK (Lymphokine-activated killer) - цитотоксичност • агресивни към клетки без HLA-I (трофобласт!) • в периферна кръв - ендометриален тип NK(uNK)

12. Имунният парадокс на бременността

13. Бременността е имунен парадокс I. Защото: • Лигавиците на женската репродуктивна система съдържат обилна лимфоидна тъкан (MALT)- APCs, NK, Th, Ts, Pl, IgG, IgA Но! - • Този женски имунен орган не реагира срещу: • спермалните ало-антигени • фетуса, който е семи-алографт

14. Бременността е имунен парадокс II. Защото: • преодолява тъканната несъвместимост между майката и плода • тъканната несъвместимост между индивидите зависи от унаследените HLA трансплантационни антигени

15. Имунология на плацентата • Фето-плацентарната единица е временен “Мирен договор” между ало-антигените на плода и имунната система на майката, който включва: - толерантност - протекция - имунотрофизъм

16. Имунологична прогноза на бременността Успешна или неуспешна бременност? зависи от: Th-2 - протекция или Th-1ембриотоксичност? което означава: Th-2 супресивен или Th-1 автоимунен отговор? Th-2 - успех, Th-1 - аборт

17. Успешната бременност е: • Th2 имунен отговор в майката • липса на HLA-DQA1 съвместимост • продукция на блокиращи антитела • насочване на NK към ембриопротекция, а не към ембриотоксичност

18. Имунологични основи на репродуктивните неуспехи

19. Стерилитет

20. Стерилитет • Стерилитет при жената 1. Тубарно-патологични промени в маточните тръби2. Ендокринни 3. Имунологични – антиспермални и антиовариални антитела 4. Малформативни – от вродени анатомични нарушения в репродуктивните органи • Често - комбинация от фактори

21. Стерилитет • Стерилитет при мъжа Патология в сперматогенезата, обусловена от герминативните функции на гонадите. Причини: • Прекарани възпалителни заболявания, не открити и не лекувани своевременно • Ендокринни заболявания • Хронични интоксикации от битов характер (никотин, алкохолизъм, наркомания, бои, печатарски мастила, пестициди!) • Травми и прекарани операции • Механични пречки (хипоспадия, скротална херния, хидроцеле, хроничен неспецифичен простатит и др.) • Имунологични фактори

22. Стерилитет • Антиовариални антитела • Яйчников резерв • Мъжки фактор • Антиспермални антитела • Интегритет на спермална ДНК

23. Антиовариални антитела • Насочени са срещу антигени – функционални участъци на зона пелуцида и гранулозните клетки с важна роля във фоликулогенезата и фертилизацията • Овариалният автоимунитет би могъл да индуцира овариална дисфункция, изявяваща се клинично с неизяснен стерилитет, преждевременна овариална недостатъчност (POF) и неуспешни IVF

24. Антиовариални антитела • блокиращи - срещу FSH рецепторите върху гранулозните клетки • срещу стероид-продуциращи клетки (плацента, надбъбречна жлеза, яйчник - hilar cells, theca cells, corpus luteum, granulosa cells) • срещу ZP-протеини - фоликулна дисфункция и блокиране на сперматозоиди

25. Антиовариални антитела • Luborsky et al., 2001- 69% от жените с POF имат антиовариални антитела • Антиовариалните антитела са асоциирани с повишен FSH при POF • Проучвания при IVF процедури показват, че жените с неуспешни цикли имат по-висок процент на антиовариални антитела

26. Яйчников резерв • Способност на яйчниците да отговарят на гонадотропини с адекватно развитие на фоликули • Отразява репродуктивния потенциал на жената • Понижението на яйчниковия резерв е биологична, а не хронологична функция на яйчниците, т.к. настъпва в различна възраст при различните индивиди • Оценка на яйчниковия резерв - при жени с малки шансове за забременяване (над 30 г), при жени с неизяснен стерилитет и при предстоящи IVF

27. Яйчников резерв • Оценка на яйчников резерв - критерии: • Възраст • Базални ендокринни тестове - FSH, LH, съотношение FSH/LH, Inhibin B (3 денот МЦ) • Динамични ендокринни тестове (напр. провокационен тест с кломифен цитрат) • Директно измерване на яйчников обеми брой фоликули • Овариална биопсия • Ден 3 от МЦ - FSH, LH, Inhibin B

28. Яйчников резерв- Inhibin B • Гликопротеинови хормони, продуцирани от гранулозните клетки на фоликули (2-5 мм), които селективно инхибират FSH секрецията чрез негативна обратна връзка. • Inhibin B(алфа/бетаВ) контролира секрецията на FSH. • Повишено серумно ниво на FSH и понижено на Inhibin B под 45 pg/ml (3 ден от МЦ) - при жени в пред-менопауза, жени, неотговарящи на гонадотропна стимулация и с ниска IVF успеваемост.

29. Яйчников резерв- Inhibin B и IVF • Сигнификантни различия в основни IVF параметри между жени с ниски и нормални стойности на Inhibin B(ден 3). • Пациентки с Inhibin B под 45 pg/ml се нуждаят от 50% повече ампули гонадотропини, имат забавяне с един ден на апликацията на hCG, 33% редукция на броя ооцити и по-малък брой трансферирани ембриони. • Този намален отговор води до - 70% по-малък брой достигнати бременности, 4-кратно повишаване на канселираните цикли и 11-кратно повишаване на спонтанните аборти при клиничните бременности.

30. Антиспермални антитела • ASA могат да бъдат насочени срещу антигени на външната акрозомална мембрана, плазмената мембрана, акрозомалния матрикс, вътрешната акрозомална мембрана, екваториалния сегмент, ядрото, шийката и опашката на сперматозоида • Антигени на сперматозоидите: BS-63,BS-17,YWK-II, BE-20, rSMP-B, HED-2 и 75- kDa

31. Антиспермални антитела • Етиология - мъже: • сперматозоидите имат чужди антигени - изявяват се в пубертета със спермогенезата, и са в имунологично привилегировани тъкани • нарушаване на кръвно-тестикуларната бариера (травма, вродена аномалия) • вазектомия - екстравазално сперматозоиди, IgM - две седмици след вазектомия, IgG - след 8-12 седмици

32. Антиспермални антитела • Честота: • n=614 - 7%мъже и 13% жени(Haas et al.) • n=300 стерилни мъже - 10.7%(Pattinson et al.) • 36 двойки - 10% жени, 15% - мъже • 77% - жени с неизяснен стерилитет, 75% - жени с ендометриоза, 60% - жени с тубарен стерилитет, 5% - контроли(Nip et al.)

33. Антиспермални антитела • Етиология - мъже: • сексуално-преносими инфекции - бактерии, вируси и фунги - хаптени, спермалната мембрана - носител Chlamydia trachomatis IgA антитела: • в семенна плазма 25% от мъжете, но 75% от тях - серонегативни • при 52% от ASA+ мъже и 16% от ASA-негативните, се установяват Chlamydia trachomatis IgA

34. Антиспермални антитела • Етиология - жени: • локално възпаление след генитална инфекция - PID (46%), lower genital tract (20%) - гъбичен, хламидиален или бактериален вагинит • 69% при жени с лапароскопски доказана тазово-адхезивна болест или хидросалпинкс

35. Антиспермални антитела • Патогенеза: • влошен мотилитет и пенетрация на цервикалния мукус • промяна в морфологията • имобилизиране и аглутиниране на сперматозоиди • влошена капацитацията и акрозомална реакция на сперматозоидите - не позволяват взаимодействие с яйцеклетката, както и последваща пенетрация през zonapellucida • кръстосана реактивност с оплодената яйцеклетка на майчините антитела и последваща фагоцитоза • предотвратяване на имплантацията и/или спиране на ембрионалното развитие

36. Millenova's SPERM DNA INTEGRITY TESTSM (SDI) • Качеството на сперматозоидите определя фертилизацията на яйцеклетките, първоначалното развитие на ембриона и имплантацията. • Определя се чрез DNA fragmentation index (DFI) и high DNA staining (HDS) • Метахроматично багрило Акридин оранж, чувствителност на ДНК към денатурация - при ниско pH се денатурира ДНК, асоциирана с протамини, не и тази с хистони. Сперматозоидите с нормална хроматинова структура няма да имат денатурация на ДНК при ниско pH. АО взаимодестващ с dsDNA (нормална) флуоресцира зелено, докато AO,свързан с ssDNA (денатурирана) флуоресцира червено при една и съща дължина на вълната - 488nm. • Оплодителен потенциал - DFI: 0-15% - висок, 16-29% - добър, над 30% - нисък до слаб

37. Инфертилитет

38. Инфертилитет - дефиниции • прекъсване на химическа бременност (доказана чрез биохимичен тест) • ранна загуба на плода/аборт на първия триместър (хистологично и УЗД доказана) • спонтанен аборт - преди 20 w.g. • мъртъв плод - след 20 w.g., неонатална смърт - след раждане на жив фетус • хабитуален аборт - три или повече последователни аборта

39. Ранна загуба на плода (EPL) • 75% от жените, с опити за забременяване • повечето - неразпознати • от разпознатите: 15-20% - спонтанни аборти или ектопични бременности, 5% - два аборта, 1% - 3 или повече аборта • Wilcox et al, 1988 - 221 жени, 707 МЦ, 198 бременности, от тях загубени - 43 (22%) - преди менстр., 20 (10%) - клинично разпознати.

40. Спонтанен аборт • всеки аборт повишава риска за следващ: - след един - 15% за следващ - след два - 25% за трети - след 3 последователни - 30-45% • кога да започне диагностичният процес?

41. Инфертилитет • Причини за повтарящи се загуби на плода • генетични - балансирани транслокации (15%) • конгенитални дефекти на матката (5% to 10%) • инфекциозни (1-5%) • ендокринни - LPD, повишен LH (5%) Останалите - • 60% от загубите на плода са имунно-медиирани алоимунни, хуморално-медиирани, клетъчно-медиирани

42. Генетични причини • Около 15% от всички разпознати бременности завършват със спонтанен аборт преди 12 г.с. • В около 80% от тях се откриват тежки структурни аномалии на плода, дължащи се на генетични нарушения. • Преобладаващи като причина, особено за бременности прекъснати в ранните срокове, са хромозомните аномалии – открити в 50-60% от тези случаите.

43. Генетични причини • Хромозомни аномалии • Вродени малформации / дефекти на плода • Наследствена тромбофилия на бременната жена

44. Хромозомни аномалии - причина за спонтанни аборти • 1. Отклонения в броя на хромозомите – най-често са ненаследствени, резултат от случайни нарушения при формирането на половите клетки на родителите • Анеуплоидии (добавъчна или липсваща хромозома) – около 70% от всички открити хромозомни аномалии. • Триплоидии (отклонения в общия брой на хромозомите) – 17-18% от хромозомните случаи. • 2. Структурни хромозомни отклонения – могат да имат наследствен характер, единият от родителите носи преустройството и има риск да го предава в потомството си. 2-4% от всички хромозомни дефекти. • 3. Транслокации (обмяна на материал между хромозоми) • 4. Инверсии (пренареждания в рамките на самата хромозома)

45. Генетична консултация - кога? • Цитогенетичен анализ: • Warburton et al., - рутинен кариотипен анализ след 1 аборт • Drugan et al., 1990 - след 2 аборта

46. Инфертилитет - имунни механизми • Алоимунни • HLA съвместимост на родителите • Автоимунни • хуморално-медиирани • автоантитела - аPL, ANA, ATA • клетъчно-медиирани • цитотксични NK и Т лимфоцити “Reproductive Autoimmune Failure Syndrome”, 1988 “Immunologic abortion”

47. HLA съвместимост на родителите • HLA-G:Сигнал от страна на бащата, стимулиращ синтеза на блокиращи антитела • Блокиращи антитела: Протектират и стимулират растежа на плацентарни клетки • Понижени блокиращи антитела: Неефективно прикриване на плацентата, плацентарните клетки не растат и не се делят и умират. Активиране на други имунни причини

48. HLA съвместимост на родителите Последствия • Неадекватна продукция на блокиращи антитела • Неефективно предпазване на плацентата • Увреждане растежа и деленето на клетките на плацентата • Смърт на плацентарни клетки • Разпознаване на плацентата като “увредено свое“ с последваща активация на други механизми

49. Анти-нуклеарни антитела • асоциират се с повтарящи се загуби на плода при пациенти без клинично автоимунно заболяване • честота: 7-53% при жени с повтарящи се загуби на плода, 0-8% при контроли • Патогенеза: Възпаление около ембриона по време на имплантация или около плацентата след имплантация

50. Тироидни автоантитела • независим маркер за повишен риск от аборт • Stangaro-Greenetal., 500 жени, изследвани за ТАТ и МАТ – по време на първи триместър: 17% - загуби на плода при АТА(+) жени (без тироидно заболяване и без промяна в хормоните, сравнени с 8.4% при АТА(-) жени. • Патофизиология – неясна, по-скоро генерализиран автоимунен механизъм, а не тироидно-индуцирана патология