A Sorting Platform Determines the Order of Protein Secretion in Bacterial Type III Systems

1. A Sorting Platform Determinesthe Order of ProteinSecretionin Bacterial Type III Systems María Lara-Tejero, JunyaKato, Samuel Wagner, Xiaoyun Liu, Jorge E. Galán* DOI: 10.1126/science.1201476, 1188 (2011);331 Science Présenté par Audrey Moine

2. Introduction • Le système de sécrétion de type 3 Injection des effecteurs en une étape Machinerie de sécrétion (20aine de protéines, homologie flagelle)

3. Introduction •Gram – 3 espèces, dont la principale est Salmonella enterica, elle-même divisée en 6 sous-espèces puis en serovar Ingestion orale • Deux types de pathologies «Salmonellose» - Gastroentérites - Syndrome typhoïque Intracellulaire facultatif, ne sort pas de la vacuole • Salmonella

4. Introduction Le système de sécrétion de type 3 chez S. entericaserovarThyphimurium http://www.epernicus.com/srd

5. Introduction • Homologie entre le flagelle et le SST3 Découverte d’une protéine cytoplasmique SpaO conservée et possédant une forte similarité de séquence avec des composants du flagelle (C-ring)

6. Etude de la fonction des composants cytoplasmiques essentiels au SST3 chez S. Typhimurium • Localisation de SpaO? • Caractérisation des intéractions de SpaO avec d’autres protéines • Rôle de SpaO dans la hiérarchie de sécrétion translocases / effecteurs? • Le rôle des chaperonnes?

7. I Localisation de SpaO • Quelle est la localisation subcellulaire de SpaO? Fig1.A: fractionnement subcellulaire de SpaO Environ 20% des protéines se trouve dans la fraction insoluble

8. I Localisation de SpaO • SpaO serait-elle en intéraction avec les protéines du sécréton? • InvG, PrgH et PrgK sont des protéines du sécréton Fig1.B: la fraction insoluble est soumise à un gradient de sucrose, et les différentes fractions sont déposées sur gel SDS-PAGE puis révélées par Immunoblot. Beaucoup de SpaO se trouve dans la même fraction du gradient que les protéines du sécréton

9. I Localisation de SpaO • Cractérisation du complexe SpaO Les protéines du sécréton seraient en interaction avec la protéine SpaO Fig I.E: Immunoblot des fractions subcellulaires insolubles sur gel natif

10. I Localisation de SpaO • Cette localisation de SpaO est-elle dépendante du sécréton? Fig I.C: Les fractions insolubles de deux souches différentes sont soumises à un gradient de sucrose puis les différentes fractions sont déposées sur gel SDS-PAGE La localisation subcellulaire de SpaO n’est pas dépendante de la présence du sécréton

11. I Localisation de SpaO • Cette localisation de SpaO est-elle dépendante de la membrane? Fig I.D: Les fractions insolubles, après différents traitements, sont déposées sur gel SDS-PAGE et SpaO est révélée par immunoblot SpaO forme donc un complexe à haut poids moléculaire même en absence de tous les composants membranaires du SST3 et de la membrane même Interaction avec d’autres protéines cytoplasmiques??

12. II Caractérisation du complexe SpaO • Quels sont les composants du complexe SpaO? Il y a de nombreuses protéines du sécréton mais aussi des translocases et des protéines cytoplasmiques. Etude des protéines cytoplasmiques Fig I.B: Gel natif 2D des fractions du gradient de sucrose et identification des protéines par LC-MS/MS

13. II Caractérisation du complexe SpaO • Est-ce qu’ OrgA et OrgB font partie du complexe SpaO? Les protéines SpaO, OrgA et OrgB forment une partie d’un complexe pouvant inclure les protéines du sécréton Fig 2.C: Analyse sur gel BN-PAGE de la fraction insoluble après application d’un gradient de sucrose chez différentes souches.

14. III Etude des translocases et effecteurs dans le complexe SpaO • SipB fait-elle partie du complexe SpaO? SipB est présente dans le complexe SpaOOrgAOrgB. Fig 3.B: Analyse sur gel BN-PAGE de la fraction insoluble après application d’un gradient de sucrose chez différentes souches.

15. III Etude des translocases et effecteurs dans le complexe SpaO • SpaOOrgA et OrgB forment un complexe protéique pouvant s’associer à des protéines membranaires du SST3. • Ce complexe peut aussi être composer de nombreuses translocases. Ce complexe pourrait servir de plateforme de sortie pour une sécrétion ordonnée des protéines Alors l’absence des translocases devrait engendrer la présence des effecteurs dans le complexe?

16. III Etude des translocases et effecteurs dans le complexe SpaO • Les effecteurs sont-ils dans le complexe en absence des translocases? L’absence de la translocase permet aux effecteurs SipA et SptP de se lier au complexe Fig 3.C: Analyse sur gel BN-PAGE de la fraction insoluble après application d’un gradient de sucrose chez différentes souches.

17. III Etude des translocases et effecteurs dans le complexe SpaO • Les effecteurs sont-ils dans le complexe en absence de translocases? L’absence des translocases permet à l’effecteur SopE de se lier au complexe. Ce complexe est donc bien une plateforme de sortie pour une sécrétion ordonnée des protéines substrats Fig 3.D: Analyse sur gel BN-PAGE de la fraction insoluble après application d’un gradient de sucrose chez différentes souches.

18. IV Le rôle des chaperonnes • Est-ce que les chaperonnes jouent un rôle dans le recrutement des protéines pour le complexe SpaOOrgAOrgB? Sans la chaperonne InvE les translocases ne peuvent plus se lier à la plateforme Fig 4.A: Analyse sur gel BN-PAGE de la fraction insoluble après application d’un gradient de sucrose chez différentes souches.

19. IV Le rôle des chaperonnes • Est-ce que les chaperonnes jouent un rôle dans le recrutement des protéines pour le complexe SpaOOrgAOrgB? Les chaperonnes sont requises pour la fixation des protéines sécrétées à la plateforme. Fig4.A.C: Analyse sur gel BN-PAGE de la fraction insoluble après application d’un gradient de sucrose chez différentes souches.

20. Conclusion • Formation d’une plateforme SpaO-OrgA-OrgB dans le cytoplasme pouvant être en interaction avec les protéines du sécréton • D’abord liaison des translocases • Ensuite liaison des effecteurs en absence des translocases • Les chaperonnes sont requises pour l’adressage des protéines sécrétées à la plateforme.

21. Conclusion

22. Discussion L’intéraction de PrgI avec la plateforme n’a pas été démontrée

23. Discussion • Aucune piste sur la manière dont le complexe substrat-chaperonne informerait sur la hiérarchie de sécrétion question d’affinité?? • Généralisation de la nécessité des chaperonnes pour l’adressage des protéines substrats à la plateforme Comment se fait la reconnaissance pour les effecteurs sans chaperonne?

24. Perspectives • De nombreux points du modèle sont encore à éclaircir • Contribution de la plateforme à l’assemblage du sécréton? • Applicable à la plupart des SST3

25. Merci de votre attention

26. II Carctérisation du complexe SpaO • Quelle est la localisation subcellulaire d’OrgA et OrgB? OrgA et OrgB se trouvent également dans les même fractions de gradient de gradient de sucrose que SpaO Fig 2.D: Immunoblot contre OrgA et OrgB sur gel SDS-PAGE des différentes fractions des gradients de sucrose.

27. II Carctérisation du complexe SpaO • SpaO, OrgA et OrgB sont-elles interdépendantes? Les protéines SpaO, OrgA et OrgB formeraient une partie d’un complexe pouvant inclure les protéines du sécréton Fig S.3: Analyse sur gel BN-PAGE de la fraction insoluble après application d’un gradient de sucrose chez différentes souches.

28. III Etude des translocases et effecteurs dans le complexe SpaO • Les effecteurs sont-ils dans le complexe en absence de translocases? En absence des translocases les effecteurs SptP et SipA sont beaucoup plus présents dans la fraction insoluble Fig 3.E: Gel SDS-PAGE des fractionnements subcellulaires

29. III Etude des translocases et effecteurs dans le complexe SpaO Fig3.F: Analyse sur gel BN-PAGE de la fraction insoluble après application d’un gradient de sucrose chez différentes souches.

30. IV Le rôle des chaperonnes • Est-ce que les chaperonnes jouent un rôle dans le recrutement des protéines pour le complexe SpaOOrgAOrgB? SicP est un cas particulier car elle reste fixée à la plateforme même après la fixation de l’effecteur. Fig 4.A: Analyse sur gel BN-PAGE de la fraction insoluble après application d’un gradient de sucrose chez différentes souches.

31. IV Le rôle des chaperonnes • La reconnaissance du complexe se fait-elle par la chaperonne ou l’effecteur? Fig 4.C: Analyse sur gel BN-PAGE de la fraction insoluble après application d’un gradient de sucrose chez différentes souches.

35. Action de InvJ • Model of needle length control. Assembly of the inner rod but not the needle requires InvJ. Completion of the inner rod leads to conformational changes on the cytoplasmic side of the injectisome, which results in substrate switching and the interruption of secretion of the inner rod and needle proteins, hence determining the length of the needle substructure. In the absence of InvJ, the socket of the base is not formed and the inner rod fails to assemble. Consequently, the secretion machinery remains locked in a secretion mode competent for the secretion of the needle protein, resulting in non-functional injectisomes with abnormally long needles. Filled circles, needle protein PrgI; open circles, inner rod protein PrgJ.