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《 基因工程 》 探索性综合性实验一

《 基因工程 》 探索性综合性实验一. 龙须菜中半乳糖 -1- 磷酸尿苷酰转移酶 (Galactose-1-phosphate uridylyltransferase ， GPU ）基因拷贝数的确定. 背景情况介绍 Division: Rhodophyta Class : Rhodophyceae Sub-class: Florideae Order: Gigartinales Family : Gracilariaceae.

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《 基因工程 》 探索性综合性实验一

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Presentation Transcript

  1. 《基因工程》探索性综合性实验一 龙须菜中半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶 (Galactose-1-phosphate uridylyltransferase，GPU）基因拷贝数的确定

  2. 背景情况介绍Division: RhodophytaClass : RhodophyceaeSub-class: Florideae Order: Gigartinales Family : Gracilariaceae

  3. TGTAGCCAAAGCTGTGCGTGGAAAATGTCGCGTTGTCTGCTTCTCCCCGAAGCTCAACCTAACTGTCGCTGAAATGGCCGTCAAGGAGATCAAGGCCGTTGTTGATGCCTGGGTTGAGGAGTATGACACCCTCTCCAAGCTCGATTACATCGGCCACGTGCAGATCTTCGAGAACAAGGGACAGATGATGGGATGCTCCAACCCTCATCCTCACGGTCAGATCTGGGCATCTGAGTTCGTTCCAGAAGAGCCGCGCATCGCACTCGCCAATCTCAAAGCCTATCACACTAAGAAGGGAACCCACATGTTGGAGGACTACGTCAAACTCGAAATGGAAGCAAAGGAACGTATCGTATGTCAGAATTGTAGCCAAAGCTGTGCGTGGAAAATGTCGCGTTGTCTGCTTCTCCCCGAAGCTCAACCTAACTGTCGCTGAAATGGCCGTCAAGGAGATCAAGGCCGTTGTTGATGCCTGGGTTGAGGAGTATGACACCCTCTCCAAGCTCGATTACATCGGCCACGTGCAGATCTTCGAGAACAAGGGACAGATGATGGGATGCTCCAACCCTCATCCTCACGGTCAGATCTGGGCATCTGAGTTCGTTCCAGAAGAGCCGCGCATCGCACTCGCCAATCTCAAAGCCTATCACACTAAGAAGGGAACCCACATGTTGGAGGACTACGTCAAACTCGAAATGGAAGCAAAGGAACGTATCGTATGTCAGAAT 该基因已克隆于pMD18T质粒载体上，长度为364bp，现可提供含有该质粒的甘油菌JM109

  4. 实验过程要求 • 根据题目通过网络和杂志查阅文献，提交实验准备报告，内容包括。 • 题目名称、原理、技术路线、具体实验步骤、需要使用的试剂（溶液）名称及其具体配制方案、其它需要使用的消耗材料（需要器皿清单） • 注意事项：独立完成

  5. 实验原理 • 基因组DNA用多种不同的限制性内切酶酶切，用GPU基因探针杂交，若有多拷贝，则应有多个杂交带，若多数酶切结果显示单一条带则为单拷贝。 技术路线 总DNA提取酶切GPU基因探针杂交显示

  6. Southern Blot 原理

  7. 探针标记（Random）

  8. 实验材料和试剂（/组） • 红藻2.5 g；CTAB缓冲液5 ml ； 酚/氯仿/异戊醇抽提液2ml ；10T/1E 1ml ；10T/0.1E 1ml；3M醋酸钠溶液1ml 变性液20 ml；中和液40ml；转移液100ml；洗膜液I 10 ml；洗膜液II 10ml；缓冲液I 100ml；缓冲液II 20ml；缓冲液III 20 ml；显色液10ml；缓冲液IV 30ml

  9. 实验步骤 • 1、红藻总DNA的提取 • 称取2.5g藻，加1~2 ml/g CTAB缓冲液（勿忘加巯基乙醇），加2g PVPP固体，在冰浴中用力充分研磨（大约半小时）。然后转移于塑料离心管中在 60-65℃ 温浴 30 min，不时颠倒混合，加蛋白酶K(10mg/ml)至终浓度100g/ml，50℃ 3h，不时颠倒混合，用等体积酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）（取下层有机相）抽提（颠倒混合）10 min，12000 rpm 离心 5 min，取上清，用氯仿抽提5 min，12000 rpm 离心 5min。取上清液，加入 2/3 体积的异丙醇，颠倒混合，在 -20℃ 下沉淀 15 min，再于室温 12000 rpm 离心 15 min，祛除上清，用1ml 70% 乙醇洗沉淀，12000 rpm 离心 15 min，祛除上清，空气干燥沉淀。37℃ 下，把核酸溶在 100-200 l TE1（10 mM Tris-Hcl，pH 8.0，1 mM EDTA）10 min，14000 rpm 离心 5 min。在不干扰沉淀的情况下，把上清液移到新的微量管中，加RNase(10mg/ml)至终浓度100g/ml，37℃消化30 min，酚-氯仿抽提后，加1/10体积3M醋酸钠和 2 倍体积 的 -20℃无水乙醇，立即离心使DNA沉淀，用 70% 的 -20℃ 乙醇洗涤沉淀DNA，空气干燥，把DNA溶在 50l TE2（10 mM Tris，pH 8.0，0.1 mM EDTA）。

  10. 2、取5l 龙须菜总DNA制品加1/10体积载样缓冲液做电泳检测，并加5l分子量对照，目测定量。 • 3、用3~4种（每组选择一种）限制性内切酶酶切 5g/种，一般20l酶切体系/1gDNA （见说明书）, 等量放大。完全酶切过夜后于80v 1.0%琼脂糖凝胶电泳1h，并加5l分子量对照。记录Marker各条带及样品位置，做Southern转迹。 • 4、探针的制备和标记 • 对提取的含目的基因的质粒，按试剂盒说明标记探针及检测标记率，按试剂盒操作说明P13表准备标记探针和对照，管2~9各1l 点于膜上，膜自然晾干，80℃烘烤2h，进行显色操作。探针稀释到终浓度10ng/l。

  11. 5、Southern Blot： • 将凝胶放入培养皿中，加入20ml变性液（没过凝胶），摇动变性1h，倾去变性液，用蒸馏水漂洗一次；换中和液20ml，摇动1h，之间更换一次中和液；在电泳槽内加适量转移液20XSSC，中间支架放一滤纸条，滤纸两端浸没在20XSSC中，滤纸与支架间不能有气泡，取出中和的凝胶，点样孔朝下倒扣于滤纸上，用玻璃棒滚动去除胶与滤纸的气泡，剪一张与胶大小相同的NC膜，放在无菌蒸馏水表面，使之自然吸水下沉，将膜转入20XSSC中浸泡5min，将湿润的膜盖在凝胶上面，膜一经与凝胶接触，不可再移动；将两张与膜大小相同的滤纸置2XSSC溶液中湿润，盖在膜上，排除气泡，滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸（高8~10cm），吸水纸上压0.5~1 kg重物，转移12h。

  12. 6、转移后，在膜上做标记，紫外检测凝胶转移效果，膜自然晾干，80℃烘烤2h。6、转移后，在膜上做标记，紫外检测凝胶转移效果，膜自然晾干，80℃烘烤2h。 • 7、膜的预杂交、杂交和显色。 • 37~42℃预热DigEasyHyb，以1.2ml/12cm2量添加该液，封膜，预杂交30min。探针100℃ 5min变性后迅速置于0℃，倾去预杂交液，以0.42ml/12cm2膜量加新预杂交液，添加10ng变性标记探针，封膜，42℃杂交过夜或68℃ 6h水浴震荡。 • 杂交完成后倒出杂交液，将膜放入小烧杯中加5ml洗涤液I，rt 洗涤5min，重复一次，倒出洗涤液，加5ml 洗涤液II，68℃洗涤15min，重复一次，取出膜于滤纸上，空气干燥。

  13. (以下为显色过程) • 膜于小烧杯中加5ml缓冲液I，洗涤1min，倒去缓冲液I，加10ml缓冲液II， rt 放置30min，倒去缓冲液II，家5ml缓冲液I，洗涤30s，取出膜置于培养皿内，以5ml含<Dig>Ap结合物的缓冲液I/50cm2膜量（内含<Dig>Ap抗体1l）添加，rt 30min，取出膜置于小烧杯中，加10ml缓冲液I，洗涤15min，重复一次，倒去缓冲液I，加缓冲液III 1.25 ml，放置2 min，（配制显色液）倾去缓冲液III，加5ml显色液，置于暗中静止待显色，显色结束取出膜加3ml缓冲液IV，洗涤 5 min，空气干燥。

  14. 实验注意事项： • 有毒害物质及其处理 • （巯基乙醇、EB、苯酚/氯仿） • 设备 • （紫外透射仪、离心机） • 统筹兼顾、提前设计 • 实验周期：4~5天 • 实验报告：实验原理、步骤、结果与讨论、建议。

  15. 《基因工程》探索性综合性实验二 龙须菜、真江蓠、扁江蓠亲缘关系研究

  16. Gracilaria verrucosa Indonesia Gracilaria verrucosa Italy Gracilaria verrucosa Japan Gracilaria verrucosa Korea, North Gracilaria verrucosa Korea, South 分布

  17. Gracilaria spp. Italy Gracilaria spp. Malaysia Gracilaria spp. Portugal Gracilaria spp. Thailand Gracilaria spp. Vietnam Gracilaria tenuistipitata var. liui China Gracilaria tenuistipitata var. liui Philippines Gracilaria tenuistipitata var. liui Thailand Gracilaria tenuistipitata var. liui Vietnam Gracilaria verrucosa Argentina Gracilaria verrucosa Egypt Gracilaria verrucosa France

  18. Gracilaria heteroclada Philippines Gracilaria heteroclada Vietnam Gracilaria howei Peru Gracilaria lemaneiformis Japan Gracilaria lemaneiformis Mexico Gracilaria lemaneiformis Peru Gracilaria longa Italy Gracilaria pacifica Canada Gracilaria parvispora United States of America Gracilaria salicornia Thailand Gracilaria salicornia Vietnam Gracilaria spp. Burma

  19. Gracilaria asisatica China Gracilaria asisatica Vietnam Gracilaria bursa-pastoris Japan Gracilaria caudata Brazil Gracilaria changii Thailand Gracilaria chilensis Chile Gracilaria chilensis New Zealand Gracilaria cornea Brazil Gracilaria cornea Caribbean Gracilaria coronopifera United States of America Gracilaria coronopifera Vietnam Gracilaria crassissima Caribbean

  20. 实验过程要求同前 实验原理 根据NCBI数据库登录的红藻基因序列，采用rDNA转录间隔区ITS1和ITS2进行亲源关系的研究。 技术路线 设计引物总DNA提取或裂解藻细胞PCR回收目的片段TA克隆转化测序分析

  21. 真核生物rDNA结构单元

  22. SSU rDNA and ITS *Curdiea/Melanthalia *Gracilariopsis/Gracilariophila:^Atlantic species *Gracilaria: ^Atlantic cylindrical henriquesiana/^gracilis/^domingensis clades

  23. ITS2: tikvahiae lineage-compressed to flatted forms with “textorri” type spermatangia and similar morphology/cervicornis lineage-low bootstrap/flatted ribbon-like species ITS1:Pacific/Atlantic/cylindrical henriquesiana lineage/gracilis lineage/flatted or compressed Atlantic species-low bootstrap value

  24. PCR技术原理

  25. 循环denature 94 C 30Sannealing Tm-5 Celongate 72 Ccycle 25-35

  26. 实验材料和试剂（/组） • 红藻2.5 g；CTAB缓冲液5 ml；LB固体培养基100ml；LB液体培养基50ml；0.75mM CaCl220 ml；预先准备冰浴，研钵，60-65℃水浴/50℃水浴

  27. 实验步骤 • 1、红藻总DNA的提取-同前 • 2、PCR反应及感受态制备准备： • 合成引物以ddH2O按说明配制成50pmol/l。在25l反应体系中按如下量 和条件进行PCR反应：10XPCR Buffer 2.5l , 10 mM dNTP 1l, primers 0.5l each, 25 mM Mg2+ 3l, Temp 2l, Tag 0.1l,以ddH2O补充终体积，液面加25l石蜡油; 94C 10 min, 94C 1min 1 min, 50C 1min 30s, 72C 2 min, 30circle。 • 现有两对引物pair1（SNria和ASria）和pair2（SNria和ASsis），对龙须菜可选用任何一对引物，但对另外两种红藻，只能用pair1。 • 要求5组混合后分装（下有PCR反应时同），各组分别加模板。 • PCR结束后取5l加1/6体积载样缓冲液，电泳检测,加分子量对照。 • （4人/组）扩增长度与设计一致（应为>1500bp），则相同条件扩大至3X50l，反应完成后，汇合，取5l加1/6体积载样缓冲液，电泳检测，其余以150l氯仿抽提，2倍体积无水乙醇沉淀过夜。 • 固体LB培养基上划线培养DH5。 • 挑取单菌落接种于3mlLB/10ml管中，370C震荡培养，12-16h。

  28. 3、感受态的制备： • 过夜培养细菌按1%转接量接种于20mlLB/100ml三角瓶中X2，370C震荡培养2-3h,至对数前期，外观微浊，00C，冰浴30min，无菌条件下，取1.5ml培养物于Ep管中，12000rpm离心 2 min，去上清，加750l 0.75 mM CaCl2悬浮，00C，冰浴15min，12000rpm离心 2 min，去上清，加100l 0.75 mM CaCl2悬浮，00C，冰浴1-2h，为感受态细胞。

  29. 4、制备1.0%琼脂糖回收胶（梳齿以胶带黏附合并），前述2沉淀以12000rpm离心10min,去上清，以30l TE溶解，加1/6体积载样缓冲液电泳，按“DNA回收试剂盒”说明回收条带。 • 5、按“pMD18T载体”试剂盒说明进行回收片段与载体的连接，其中pMD18T载体用0.5l，连接液(solution I)用5l，总连接体积10l。

  30. 6、转化： • 将连接产物加入上述感受态细胞中，混匀，冰浴30 min，放入420C水浴中静置60 s,取出，冰浴1min，加入800l LB培养基，370C 震荡培养，45min，15,000rpm离心 1min,去700l上清,各取100l涂布固体LB(Amp终浓度 100g/ml)平板，共两个，370C 培养过夜。

  31. 7、重组体检测： • 以牙签挑取单菌落转接加Amp保存母板（每大组准备一个保存母板，加Amp，并在平板背面划格分割），同时在通用引物进行的PCR检测管中洗涤牙签以加入模板（整个菌体为模板），检测插入片段的长度，在20l反应体系中按如下量和条件进行PCR反应：10XPCR Buffer 2.5l, 10 mM dNTP 0.4l, primers (U1/U2) 0.1l each, 25 mM Mg2+ 2.4l, Tag 0.1l,以ddH2O补充终体积，液面覆盖石蜡油; 94C 10 min, 94C 1min 30 s, 50C 1min 30s, 72C 1 min 30s, 30circle。要求5组混合后分装，各组分别加模板。

  32. 8、电泳检测插入长度正确的（1600~1700bp），在3ml 含Amp的LB培养基中培养过夜，取0.85ml培养菌液，加终浓度15%甘油，混合后送测序。 • 9、序列同源性分析。 软件：Clustal/Macaw

  33. 实验注意事项： • 前述 • PCR反应的均一性 • 无菌操作 • 实验周期：4~7天 • 实验报告：实验原理、步骤、结果与讨论、建议。

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