Kromatográfia

1. Kromatográfia Ajánlott irodalom Balla József: A gázkromatográfia analitikai alkalmazásai, Abigél Bt., Budapest, 1997. Fekete Jenő: Folyadékkromatográfia, BME jegyzet, Budapest, 2003. Gáspár Attila: Kapilláris zónaelektroforézis, DTE, Debrecen, 2000.

2. Kromatográfia előnyei a környezeti analízisekben • Pontos meghatározás nyomnyi mennyiségekre • Mátrixkomponensek zavaró hatása kiküszöbölhető • Kicsiny mintaszükséglet • Széles lineáris meghatározási koncentráció tartomány • Több meghatározás egy analízis során • Gyors módszer • Jól kapcsolható anyag meghatározási technikákhoz (MS, UV-VIS, IR). • Fejlett műszerezettség, automata üzemmód

3. Egy analízis alatt számos komponens meghatározása megoldható 106 közepesen illékony szennyező anyag GC-MS analízise

4. Kromatográfiás folyamat • Kromatográfia elválasztási módszer. • Kromatográfiában az állófázis és a mozgófázis között megoszlanak az anyagok megoszlanak egyensúlyi állandójuk szerint. • A mozgófázis magával ragadja a vizsgálandó anyagot, amely így a beinjektálási ponttól a detektorig jut. • Az állófázissal erősebb kölcsönhatással rendelkező anyagok később eluálódnak mint a gyengébb kölcsönhatással rendelkezők. • Az anyagok vándorlásuk során egyre szélesebb tartományt foglalnak el.

5. Egy csúcs megoszlása az állófázis és mozgófázis között A mozgófázis magával ragadja a minta molekuláit. Az állófázisban lévő anyag lemarad a mozgófázisban lévőtől A lassú anyagátadás (anyagátadási ellenállás) miatt.

6. Kromatográfia folyamata Az anyagok a kromatográfiás oszlopon áthaladva elválnak egymástól, miközben egyre szélesebb zónát foglalnak el a diffúzió és a lassú anyagátadás miatt és magasságuk (jel-zaj viszony) csökken.

7. Kromatográfia felosztása mozgófázis szerint • Gázkromatográfia, (GC) • Folyadékkromatográfia (LC), nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) • Szuperkritikus oldószeres kromatográfia (SFC) • Elektrokinetikus kromatográfia (EKC)kapilláris elektrokinetikus kromatográfia (CEC)

8. Kromatográfia felosztása oszlop szerint • Töltetes oszlop kromatográfia • Kapilláris oszlop kromatográfia • Chip kromatográfia • Vékonyréteg kromatográfia (TLC) Kromatográfia felosztása kölcsönhatások szerint • Megoszlásos kromatográfia • Adszorpciós kromatográfia • Kizárásos, gél (exclusion) kromatográfia • Ioncserés kromatográfia

9. Elméleti tányérszám N = 5,54 (tR/wh)2 Kapacitás arány k = tR’/t0 tR: retenciós idő wh: csúcs félérték szélessége Kromatográfiás kifejezések A csúcs Gaus görbe alakú

10. Kromatográfiás kifejezések Szelektívitás • = tR2’/ tR1’ Felbontás Rs = 1,177 (tR1-tR2)/wh1+wh2) Rs : 1,5 alapvonal felbontás

11. Gázkromatográf (GC) vázlata Gázpalack helyett lehet H2 generátor is.

12. GC-s kapilláris keresztmetszete Általános paraméterek Hossz, 5-50 m Átmérő: 0,1-0,5 mm Filmvastagság: 0,1-5 µm Oszlop anyaga: kvarc Állófázis: hőstabil szilikon vagy PEG polimer Ma már jóformán csak kapilláris oszlopot használnak GCben.

13. Oszlophossz hatása Hosszabb oszlopon jobb a felbontás, de időigényesebbek az analízisek.

14. Állófázis filmvastagságának hatása Vastag filmvastagságú oszlopokat illékony komponensek (benzin, formaldehid, VOC) analízisére használjuk.

15. Ipari oldószerek GC analízise Speciális feladatra tervezett állófázisokat is árulnak

16. Tömegspektroszkópia (MS) elve • Tömegspektroszkópia anyagazonosítási módszer. • Az anyagokat ionizált formájukban analizáljuk. Az ionizálás hatásra az anyag részekre eshet (fragmentálódhat). • Az ionok vákuumban (10-7 torr) mágneses és elektromos erők hatására az ellentétes pólus felé repülnek, anélkül, hogy más ionokkal ütköznének. • Az ionok röppályája (sebessége, elhajlása) függ tömegüktől és töltésüktől. A nagyobb tömegű ionok kisebb sebességgel repülnek, vagy a mágneses tér hatására kevésbé görbül el röppályájuk .

17. Nagyhatékonyságú kromatográf (HPLC) vázlata A gázmentesítés (degasser) fontos, hogy a pumpa folyadékot tudjon felszívni, és csökkenjen az alapvonal zaj (noise).

18. Folyadékkromatográf pumpája A folyadékáram pulzálását, és evvel együtt a detektorzajt két pumpával csillapítják.

19. Gradiens elúciós folyadékkromatográfia Folyadékkromatográfiában a mozgófázis összetételének változtatásával szabályozzuk a mozgófázis erősségét. A gradiens gyorsabb analíziseket és jobb kimutatást biztosít.

20. Forgócsapos (rotary valve) injektálás HPLCben A hurok (loop) pontos mennyiségű, áramlás megzavarása nélküli beinjektálást biztosít.

21. A leggyakrabban használt C18 HPLCs állófázis szerkezete Apoláris anyagoknak nagyobb a retenciója. Mozgófázis poláris oldószer (víz, metanol, acetonitril).

22. A normál fázisú , szilika HPLCs állófázis működése Polárosabb anyagoknak, nagyobb a retenciója. A mozgófázis apoláris oldószer (hexán, tetrahidrofurán, diklórmetán stb.).

23. Oldószerek polaritási sora A polarítás összege lefelé növekszik a nyíl mentén.

24. Oldószererősség hatása fordított (C18) HPLCs állófázison Az oldószererősség csökkenésével nő a retenció, felbontás és az analízis időszükséglete.

25. Karbamát rovarölő szerek HPLC-UV analízise speciálisan kifejlesztett állófázison Az anyagok hőbomlásuk miatt nem alkalmasak GCs elemzésekre.

26. Gélkromatográfia (méretkizárásos, size exclusion), alapja A nagy molekulák mivel nem férnek be a kis csatornákba kisebb kölcsönhatással bírnak, ezért hamarabb elúálódnak.

27. Ioncserés kromatográfia elve Az állófázis ionjai visszatartják az ellentétes töltésű ionokat. Az erősebb ionoknak ( Cl- > CO32-) nagyobb a retenciója.

28. Tömegspektroszkópia folyamata • Anyag bejutatása a készülékbe Közvetlen (ICP, MALDI) On-line előszeparációval (GC/MS, HPLC/MS, EKC/MS) • Ionizáció Elektronütközéses ionizáció (EI) Kémiai ionizáció (NCI, PCI, MALDI, ICP) Elpárologtatásos ionizáció folyadékból (ESI, APCI) • Szeparálás Mágneseses szektor Qadrupol Repülési idő (TOF) • Detektálás

29. Tömegspektroszkópia folyamata • Anyag bejutatása a készülékbe Közvetlen (ICP, MALDI) On-line előszeparációval (GC/MS, HPLC/MS, EKC/MS) • Ionizáció Elektronütközéses ionizáció (EI) Kémiai ionizáció (NCI, PCI, MALDI, ICP) Elpárologtatásos ionizáció folyadékból (ESI, APCI) • Szeparálás Mágneseses szektor Qadrupol Repülési idő (TOF) • Detektálás

30. Fragmentáció szemléltetése A fragmensekből összerakható az eredeti molekula.

31. Mágneses szektorú MS működése Minnél nagyobb a tömeg, annál nagyobb az ív. Gyakorlatban a mágneses tért változtatják (scann), hogy mindegyik ion érje a detektort.

32. Quadrupol tömegspektrométer működési vázlata

33. Totál ionkromatogram (TIC) és szelektált ion monitorozó (SIM) mód összehasonlítása A SIM több nagyságrenddel érzékenyebb mint a TIC.

34. Szenzoros mérések

35. Szenzoros mérések elve • Az állatok testébe a kiválasztott méreganyaggal immunreakciót indukálunk, ami létrehozza az antitestet, vagy a mérendő anyagról lenyomatot készítenek. • Az antitestet kinyerjük az állatból és tisztítjuk. • Az antitest és a mérendő anyag reakciója a mérés alapja. • További antitestekkel és jól detektálható csoportokkal (sugárzó, fluoreszkáló stb.) a szelektivitás és az érzékenység.

36. Közvetlen módszer A mintamolekulák és a „világító” anyagok bekötnek a receptorra (antitest, lenyomat). A bekötött molekulák aránya megegyezik koncentrációjuk arányával. A detektálás a bekötés helyén, vagy a kimosott oldatban történik.

37. Méré elve Az adszorbeált anyagok megváltoztatják az optikai úthosszat és evvel az interferáló hullámhosszat is.

38. Környezetvédelmi mérések követelményei • A méréseknek megbízhatóságát megbízhatóan igazolni kell. • Az elvégzett mérések máshol is elvégezhetőnek kell lennie. • A mérés határait (koncentráció, mátrix, műszer) be kell tartani. • A méréseknek összhangban kell lenni a rendeletekben megadott határértékekkel. • Az eredményeknek jogilag is védhetőknek kell lenni.

39. Validálás és hitelesítés értelme Az analitikai laboratóriumokkal szemben támasztott igények megkövetelik, hogy a laboratóriumok mérési eredményei megbízhatóak, ellenőrizhetőek és visszakereshetőek legyenek. Ennek megfelelően egy analitikai módszer kidolgozásakor feltétlenül szükséges a tevékenység teljesítményét jellemző paraméterek meghatározása, statisztikai értékelése és megfelelő jelentés formájában történő dokumentálása.

40. Validálást, egy teljes hitelesítési folyamatot egy új módszer bevezetésnél végig kell csinálni. Máshol bevezetett módszer, szabvány átvételénél csak részleges hitelesítést kell végrehajtani. Minden mérés sorozat előtt, a mintával összhangban kalibrálni kell a mérő műszert. A méréssorozat során 5-8 mérésenként minőségi ellenőrző méréssel (quality control QC) ellenőrizni kell a rendszer változatlanságát.

41. Szelektivitás és/vagy specifikusság (Selectivity / specificity) • Egy módszer szelektivitása arra vonatkozik, hogy a módszer milyen mértékben képes az adott alkotó meghatározására egyéb zavaró alkotók jelenlétében. • Specifikus az a módszer ami, csak egyetlen anyagra vonatkozik (pl. MS fragmentáció, O2 elektród). • Csoport szelektív módszer az anyagok csoportját mutatja közös egy közös tulajdonságáguk alapján (pl. NPD, immunreakciók). • Univerzális módszer az anyagok széles spektrumára érzékeny (pl. savasság, FID, 254 nm abszorbancia). • A zavaró jelek a vak mintában is jelet adnak, a kalibráló egyenesnek nem origó a tengelymetszete.

42. Linearitás (Linearity) • Az analitikai mérőgörbe linearitásán azt értjük, hogy a mérőgörbe adott tartományában, az ún. lineáris tartományban, adott megbízhatósággal egyenesnek tekinthető. A linearitást a méréstartományt lefedő koncentrációjú minták elemzésével határozzuk meg. Az eredményekből a legkisebb négyzetek módszerével számítjuk ki a regressziós egyenest az alkotó koncentrációja függvényében.

43. Mérésének kalibráló egyenese A kalibrálás egyenesét regressziós egyenessel, a legkisebb négyzetek alapján számítjuk. Általános elvárás, hogy az R2> 0,98 legyen.

44. Érzékenység (Sensitivity) • Azmérésérzékenysége (a) az analitikai mérőgörbe meredeksége, a mért analitikai jelnek (J) a koncentráció (c) vagy az anyagmennyiség szerinti deriváltja. Ily módon az érzékenység, azaz az egységnyi koncentrációváltozásra eső jelváltozás egyszerűen számítható, az a = J/c összefüggés alapján (pl. UV, AAS). • Relatív érzékenység (f): a mérés érzékenységének és egy vonatkoztatási anyagra (belső standard, s index) kapott érzékenységnek a viszonya (hányadosa), a relatív jelek és a hozzájuk tartozó koncentráció (vagy tömeg) hányadosok adataiból szerkesztett analitikai mérőgörbe meredeksége. J/Js = f(c/cs) a mennyiségi elemzés belső standard módszerének alkalmazásakor használatos (pl GC).

45. Torzítatlanság (Accuracy) • A torzítatlanság (vagy pontosság) a rendszeres hiba kimutatására szolgál, a különböző koncentrációknál meghatározható rendszeres hibák átlagolódásával keletkező mérési jellemző (pl. vakérték). A rendszeres hibát úgy definiálhatjuk, mint a hiba egy olyan elemét, amely ugyanazon alkotó ismételt mérése során állandó marad vagy kiszámítható módon változik. Független az elvégzett mérések számától és ezáltal azonos mérési körülmények között a mérések számának növelésével nem csökkenthető.

46. Precizitás (Precision) • A precizitás a mérési gyakorlatban a véletlen hiba mérőszáma. A véletlen hiba rendszerint a befolyásoló mennyiségek előre nem látható változásaiból ered. Az analitikai eredmény véletlen hibája nem korrigálható, de a mérések számának növelésével rendszerint csökkenthető. Értéke általában függ az alkotó koncentrációjától, ezért a koncentrációfüggést is meg kell határozni és dokumentálni kell.Mértéke a becsült tapasztalati szórás (standard deviáció, SD), vagy a százalékos szórás (relatív standard deviáció, RSD%). _ xiaz egyes mérések értéke, xiaz n párhuzamos mérés átlaga.

47. Torzitatlanság, precizitás, véletlenszerű és szisztematikus hiba szemléltetése

48. Ismételhetőség és/vagy reprodukálhatóság (Repeatibility/Reproducibility) • Az ismételhetőség a precizitás azon fajtája, amely ismételhető körülmények között elvégzett kísérletekre vonatkozik: azonos minta, azonos módszer, azonos műszer, azonos kezelő, azonos laboratórium, rövid időintervallum a párhuzamos mérések között. • A reprodukálhatóság a precizitás azon fajtája, amely reprodukálható körülmények között elvégzett kísérletekre vonatkozik: azonos minta, azonos vagy különböző módszer, különböző műszer, különböző analitikus, különböző laboratórium, hosszabb időintervallum a párhuzamos mérések között.

49. Stabilitás (Stability) • A stabilitásvizsgálat a mérésre előkészített minta kémiai stabilitásának (pl. párolgás, hidrolízis, rohadás) meghatározását jelenti. Segítségével ugyanis a mérés időbeni korlátai határozhatók meg, azaz egy olyan időintervallum, amelyen belül az előkészített minták elemzési folyamatát be kell (lehet) fejezni. • Az eredmények szórása, és az átlagtól való eltérésüket változása nem követhet egyirányú tendenciákat. • A méréssorozat közben kontrol (QC) mintákkal kell a mérés körülményeinek változatlanságát ellenőrizni.

50. Kimutatási határ (Limit of detection, LOD) • Egy alkotó kimutatási határa (Ck) az a koncentráció, vagy anyagmennyiség, amelyhez tartozó válaszjel (Jk) értéke megegyezik a vakminta közepes válaszjelének (Jvak) és a vakminta válaszjeléhez tartozó tapasztalati szórás (SDvak) háromszorosának összegével.