Hodowle tkankowe, komórki macierzyste

1. Hodowle tkankowe,komórki macierzyste

2. Typy hodowli • Pierwszorzędowe = pierwotne • Wtórne • Linie komórkowe • Linie unieśmiertelnione • telomeraza • onkogeny • onkowirusy • nowotworowe

3. Pojęcia • Medium = pożywka • Zdefiniowane • Niezdefiniowane • Bezsurowicze • Skład: • Aminokwasy – 9 egzogennych (His, Ile, Leu, Liz, Met, Phe, Thr, Trp, Val); dodatkowo Cys, Gln, Tyr • Witaminy • Sole,glukoza • Surowica – zawiera insulinę, transferynę • Czerwień fenolowa • Dodatki: IL-2 dla limfocytów T, erytropoetyna dla erytrocytów

4. Warunki hodowli • Temperatura • Tlen, dwutlenek węgla • pH • Wilgotność powietrza

5. Laboratorium

6. Hodowle imitujące warunki fizjologiczne • ko-kultury • hodowle podtrzymujące z ang. „feeder layers” • hodowle 3D na odpowiednich matrycach • hodowle uniemożliwiające adhezję

7. Izolacja komórek Oddzielenie od macierzy międzykomórkowej i rozbicie na pojedyncze komórki rozdrobnienie mechaniczne tkanki trawienie enzymami proteolitycznymi traktowanie EDTA –wiąże jony wapnia potrzebne do kontaktu komórka-komórka Rozbicie komórek szok osmotyczny ultradźwięki przecieranie przez sita homogenizacja

8. Rozdział frakcji • Cytometr przepływowy z sorterem • Chemotaksja • Adhezja • Wirowanie • Obecność markerów – antygenów powierzchniowych • Tworzenie CFU

9. Cytofluorymetria przepływowa z sorterem

10. MACS – rozdział immunomagnetyczny

11. Schemat izolacji immunomagnetycznej Selekcja pozytywna Selekcja negatywna

12. Izolacja chemotaktyczna Komórki jednojądrowe ze szpiku kostnego SDF-1 LIF Medium HGF

13. Wirowanie • W gradiencie gęstości: • frakcje wędrują w zależności od rozmiaru i kształtu gdy użyje się niskiego gradientu cukru (5-20%); • w zależności od gęstości frakcji, gdy użyje się wysokiego gradientu cukru (20-70%) • W gradiencie prędkości: • frakcje wędrują w zależności od ciężaru – im mniejsza frakcja tym większej prędkościtrzeba użyć

14. Liczenie komórek • cytometr • Komora Burkera • Średnia ze zliczeń • Gęstość komórek /cm3: • C=n* 105 n- ilość zliczonych komórek

15. Określenie żywotności • Błękit trypanu – martwe-niebieskie jądra • Bromek etydyny – martwe-jądra czerwone • Jodek propydyny- martwe – jądro czerwone • Dwuoctan fluoresceiny – żywe – zielona fluorescencja cytoplazmy

16. Komórki macierzyste • Typy • Embrionalne ESC • Somatyczne • Z krwi pępowinowej

17. Cechy komórki macierzystej • Nieograniczona ilość podziałów • Zdolność do różnicowania • Zdolność samoodnawiania Świat nauki 05/2002

18. Podziały • Bardzo rzadkie • Symetryczne • Asymetryczne • Regulacja Świat nauki 07/1999

19. Typy komórek macierzystych • Totipotencjalne • Pluripotencjalne • Multipotencjalne • Unipotencjalne www.wi.mit.edu

20. Blastocysta • Blastocysta = trofoblast + węzeł zarodkowy • Trofoblast tworzy łożysko • Komórki węzła zarodkowego tworzą 3 listki zarodkowe www.kumc.edu

21. Blastocysta • 0,1 –0,2 mm średnicy • 100 –150 komórek www.kumc.edu

22. Hodowla • Komórki węzła zarodkowego • Warstwa odżywcza z inaktywowanych fibroblastów mysich • Surowica bydlęca Świat nauki 06/1999

23. Różnicowanie mezenchymalnych komórek macierzystych MSC Osteoblasty Osteoklasty

24. zwiększenie aktywności alkalicznej fosfatazy tworzenie ognisk mineralizacji zmiana morfologii i gromadzenie kropli tłuszczu zmiana morfologii i odkładanie proteoglikanów

25. ZALETY: Pluripotencjalne Zgodność antygenowa – brak odrzutu WADY: Trudna hodowla Nieprzewidywalny kierunek różnicowania Potworniaki 20% Problemy etyczne ESC

26. Klonowanie terapeutyczne • Jądro komórki somatycznej wprowadzane do pozbawionego jądra oocytu • Cytoplazma oocytu „odmładza” jądro • Embrion hodowany do stadium blastocysty www.biochem18.stanford.edu

27. Problemy • Źródło oocytów • Nieznana wydajność tej techniki • Wydajność 14% -na 1 linię 280 oocytów • Oocyty zwierzęce www.lef.org

28. Partenogeneza • Niezapłodniony oocyt pobudzany do rozwoju • Podwójny zestaw chromosomów dawcy oocytu • Komórki pluripotencjalne www.bedfordresearch.org

29. Odróżnicowanie • Izolacja enzymów oocytu „odmładzających” jądro • Iniekcja do komórki hematopoetycznej • Komórki odzyskują pluripotencjalność www.ohsu.edu

30. Płodowe komórki macierzyste FSC • 5-9 tygodniowe płody • Izolacja komórek linii płciowej • Pierwotne komórki zarodkowe EG www.molbio.princeton.edu

31. Migracja ESC do organizmu matki • Zaostrzenie chorób autoimmunolo – gicznych • Migracja do miejsca uszkodzenia i regeneracja tkanek – ochrona matki Świat nauki 12/2005

32. Krew pępowinowa • Alternatywne źródło krwiotwórczych SC • Przeszczepy autogeniczne i allogeniczne • Możliwość bankowania • 130 tys. porcji zbankowanych • 3500 przeszczepów www.hemastem.com

33. ZALETY: Dostępność i czas Bezpieczna metoda pobrania Większa pula dostępnych dawców Młode SC Mniej nasilone GvH Minimalne ryzyko zakażenia CMV Brak dylematów moralnych WADY: Porcja 100 ml bezpieczna dla biorcy 30 kg Opóźnione zasiedlanie szpiku Ryzyko obciążeń genetycznych Nieznany wpływ bankowania Mniej SC niż w szpiku i krwi mobilizowanej Krew pępowinowa

34. Możliwości zastosowania krwi pępowinowej • Leczenie białaczek • Leczenie pacjentów po chemioterapii lub radioterapii • Uzyskanie komórek nerwowych • Uzyskanie komórek mezenchymalnych, trzustkowych i hepatocytów www.waisman.wisc.edu

35. PUBLICZNE: Krew sklasyfikowana pod względem HLA Przeszczepy allogeniczne Ponoszą wszystkie koszty Ogólnodostępny rejestr dawców Dowolny biorca KOMERCYJNE: Przeszczepy autogeniczne lub w obrębie rodziny Nie ponosi kosztów Ryzyko zakończenia działalności i zniszczenia komórek Banki krwi pępowinowej

36. Somatyczne komórki macierzyste • Niezróżnicowane • Ograniczona proliferacja • Liczba z wiekiem maleje • Efekt starzenia • Dostosowanie do niszy tkankowej • Nie tworzą potworniaków • Stan uśpienia www.rsna.org

37. Występowanie somatycznych SC • szpik • mięśnie – komórki satelitarne • skóra • jelito • wątroba • mózg

38. ZALETY: Brak dylematów etycznych Nie tworzą się potworniaki WADY: Trudność pozyskania Brak zgodności tkankowej Efekt starzenia W stanach chorobowych lub martwicy mniejsza liczba Wykorzystanie somatycznych SC

39. Przeszczepy • Autologiczne • Allogeniczne • Ksenogeniczne • Narządów • Tkanek • komórek

40. Możliwości wykorzystania • Badania embriogenezy • Badania nieprawidłowego rozwoju • Badania działania genów • Testowanie leków • Badanie teratogenów • Zastosowania medyczne www.kumc.edu

41. Ograniczenia • Możliwość odrzutu przeszczepu allogenicznego • Linie hodowane na mysich fibroblastach i surowicy cielęcej – możliwość transmisji patogenów • SC pobierają mysie białko i prezentują je na swojej powierzchni – odrzucenieprzeszczepu • Trudności uzyskania, hodowli i różnicowania • Kontrowersje etyczne www.zaman.com

42. Oparzenia • Skóra wyhodowana in vitro dostępna komercyjnie • Przeszczep odtwarza włosy i gruczoły łojowe • Prawidłowy układ strefy wzrostu www.times.hankooki.com

43. Zawał serca • W Polsce 100 tys. rocznie • Nekroza kardiomiocytów • Blizna łącznotkankowa • Przebudowa ściany Świat nauki 12/2004

44. SSC w terapii pozawałowej -próby przedkliniczne • Myszy, szczury, owce, świnie • Poprawa kurczliwości • Indukcja angiogenezy • Prawidłowe ułożenie • Ochrona przed dalszą degeneracją • Po miesiącu 38% blizny zastąpione tkanką mięśniową www.worldhealthspecialists.org

45. Badania kliniczne • Poznań i Paryż • Podanie podczas bypassów lub przezskórnie • Makrofagi + SC • Większość komórek nie przeżywa • Zwiększenie frakcji wyrzutowej z 35% do 42% www.dir.nhlbi.nih.gov

46. Cukrzyca typu I • SSC trzustkowe • Różnicowanie ESC w komórki wysepek trzuskowych • Produkcja insuliny • Możliwy przeszczep w nie fizjologicznej lokalizacji – pod torebkę nerki www.stemcells.nih.gov

47. Uszkodzenia wzroku • Stosowana terapia • SSC z rąbka rogówki • In vitro hodowana błonka wszczepiana w miejsce uszkodzenia • Oparzenia rogówki www.stemcell.umn.edu

48. Choroba Parkinsona • ok. 300 pacjentów • ESC lub SSC • Tworzyły połączenia neuronalne, produkcja dopaminy • 50% redukcja objawów • Efekt utrzymywał sięprzez 5-10 lat • 90-95% komórek zamiera po przeszczepie • Na 1 pacjenta potrzeba 6 płodów www.stemcells.nih.gov

49. Udar mózgu oraz uszkodzenia rdzenia kręgowego • Podanie dożylne • Angiogeneza, neurogeneza, regeneracja funkcjonalna • Wydzielają czynniki neuropoezy www.rsna.org

50. Zęby • Badania na myszach • SC z miazgi zębów mądrości • 15 – 20% miało prawidłowy układ tkanek • Ograniczenia: • Źródło • Rozwój w szczęce dorosłego • Tworzenie korzeni • Przewidywalna wielkość i kształt Świat nauki 9/2005