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核酸含量测定

核酸含量测定. 定磷法. 核酸定量测定常见的方法. 1. 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸含量，反应灵敏。 2. 紫外吸收法：利用核酸在 260nm 处有吸收高峰，操作简便，受蛋白质和核苷酸的干扰影响。 3. 地衣酚法：用于测定 RNA 的含量， RNA 与浓盐酸共热，降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定，特异性差，戊糖均有此反应。 4. 二苯胺法： DNA 中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为 ω - 羟 - γ - 酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应，除脱氧木糖和阿拉伯糖外其他糖类无此反应。. Vit • C. 定磷法的原理.

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核酸含量测定

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  1. 核酸含量测定 定磷法

  2. 核酸定量测定常见的方法 • 1. 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸含量，反应灵敏。 • 2. 紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰，操作简便，受蛋白质和核苷酸的干扰影响。 • 3. 地衣酚法：用于测定RNA的含量，RNA与浓盐酸共热，降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定，特异性差，戊糖均有此反应。 • 4. 二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω-羟-γ-酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应，除脱氧木糖和阿拉伯糖外其他糖类无此反应。

  3. Vit • C 定磷法的原理 首先将核酸样品用硫酸消化成无机磷，利用定磷试剂测定无机磷量。反应式为： • (NH4)MoO4+H2SO4 H2MoO4+(NH4) 2SO4 • H3PO4+12H2MoO4 H3P(Mo3O10) 4+12H2O • H3P(Mo3O10) 4 Mo2O3 •MoO3（钼蓝）

  4. 还原产物钼蓝在波长660nm测定吸光值，当无机磷含量在1—25μg 范围内，光吸收和含磷量成正比。 RNA的含磷量为9.5%，即1μg RNA磷相当于10.5 μg RNA。DNA的含磷量平均为9.9%。

  5. 试剂 • 酵母RNA样品溶液：2000μg/mL • 标准磷原液：含磷量为1000 μg/mL • 标准磷溶液：含磷量为10 μg/mL，每组用干试管取15mL • 定磷试剂：含硫酸、钼酸铵、Vit.C，浅黄色，如果变绿则不能使用,每组用100mL烧杯取70mL

  6. 实验步骤 1. 核酸样品用硫酸消化，将有机磷转化成无机磷； 2. 制定定磷标准曲线； 3. 测定回收率和样品总磷量。

  7. 1. 样品消化（每两组或三组做一份）

  8. 2. 定磷标准曲线的制定（每人做一份） 每人取18支试管，按照下表平行操作：

  9. 3. 测定总磷量和回收率（与2同时进行）

  10. 数据处理 • 关于空白： 1—6号管用于绘制定磷标准曲线，1号管作为空白。 7—9号管用于样品及回收率的测定，7号管作为空白。 • 以每管含磷量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标画标准曲线，直线应过原点。 • 在标准曲线上查出样品(x)和标准磷(y)的含磷量(μg)。

  11. 计算回收率： • (2) 计算样品总磷量： • (3) 计算RNA量： • (4) 样品RNA含量：

  12. 操作注意事项 1. 每人独立操作，不允许两人穿插取样； 2. 要求试剂及所有器皿清洁，不含磷； 3. 每管加样和测定均要求平行操作； 4. 消化溶液定容后务必上下颠倒混匀后再取样； 5. 各种试剂必须用移液管按顺序准确量取，移液管口用吸水纸擦净，溶液尽量加到试管下部，标准溶液要求用差量法。 6. 漩涡混合器的使用：用点动档，试管竖直或稍倾斜垂直向下用力。 7. 测定吸光值时，用一个比色杯装去离子水调节分光光度计零点，另一个比色杯按照从低浓度到高浓度的顺序测定，不用润洗，切忌甩比色杯，将蓝色溶液撒在仪器和地面上。

  13. 思考题 • 1. 回收率的意义； • 2. 实验所用的水质、试剂质量、定磷试剂的酸度对测定结果的影响。

  14. 实验结束 • 将试管洗净，斜插在试管架上，放在台面上。 • 将消化管和橡皮塞洗净，放回原处。 • 将比色杯洗净，放在实验台上的小平皿中。 • 将实验台面擦干净。

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