研究生实验技能培训 －－ 化学分析常用仪器介绍

1. 研究生实验技能培训－－化学分析常用仪器介绍研究生实验技能培训－－化学分析常用仪器介绍 实验中心 谭炳炎

2. Waters 1525高效液相色谱仪

3. 工作原理 • 储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相) 内。 • 由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。

4. 仪器组成（主要技术参数） • 1. 高压泵 恒压泵；恒流泵 • 2. 层析柱及其填充 进样器；柱管；层析柱的填充（干装法、半干 装法、浆装法） • 3. 紫外光检测器 固定波长型；可变波长型；扫描型 • 储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪（柱温箱、二极管阵列检测器） • 种类：分析型 制备型

5. 基本概念和术语 • 色谱图和峰参数 • 色谱图 • 基线 • 噪音 • 漂移 • 色谱峰 • 拖尾因子 • 峰底 • 峰高 • 半峰宽 • 标准偏差 • 峰面积 • 峰面积

6. 主要用途 • 有机化合物的定性定量分析，尤其是沸点较高和热稳定性较差的化合物，如染料农药、药物、生物碱、核酸、石油产品，高分子化合物及其中间体等。 • 也适合中药、功能食品等产品中有效成分含量特征分布图谱的建立。 • 广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等各种领域。

7. 高效液相色谱对于挥发性低、热稳定性差、分子量大的高分子化合物以及离子型化合物的分离尤为有利。高效液相色谱对于挥发性低、热稳定性差、分子量大的高分子化合物以及离子型化合物的分离尤为有利。 • 如氨基酸、多肽、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、类脂、维生素、抗菌素等均可进行分离分析定量。

8. 应用实例 • 复方解热镇痛片的分析 • 维生素类药物的分析 • 激素类药物的分离 • 生物碱的分析 • 核苷与核苷酸的分离鉴定

9. 定性、定量分析 • 1.定性： 色谱鉴定法（纯物质对照法） 非色谱法定性（化学定性方法，两谱联 用法定性） • 2.定量分析： 外标法；内标法；内加法；归一化法

10. 高效液相色谱仪与结构仪器的联用是一个重要的发展方向。高效液相色谱仪与结构仪器的联用是一个重要的发展方向。 • 液相色谱- 质谱连用技术受到普遍重视, 如分析氨基甲酸酯农药和多核芳烃等。 • 液相色谱- 红外光谱连用也发展很快,如在环境污染分析测定水中的烃类, 海水中的不挥发烃类, 使环境污染分析得到新的发展。

11. 实验须知 • 样品处理： • 自备试剂： • 结果分析：

12. 常见故障 • 故障1 流动相内有气泡，关闭泵，打开泄压阀，打开purge键，清洗脱气，气泡不断从过滤器冒出，进入流动相，无论打开purge 键几次，无法清除不断产生的气泡。 • 原因 过滤器长期沉浸于乙酸铵等缓冲液内，过滤器内部由于霉菌的生长繁殖，形成菌团，阻塞了过滤器,缓冲液难以流畅地通过过滤器，空气在泵的压力作用下经过滤器进入流动相。

13. 处理办法 (1)过滤器浸泡于5 %硝酸溶液中，超声清洗几分钟即可。 (2)如仍有气泡不断从过滤器冒出, 继续将过滤器浸泡于5 %硝酸溶液中。 (3)打开泄压阀，打开泵，流速调至1. 0～3. 0ml/ min ，纯水冲洗过滤器1 小时左右，即可将过滤器清洗干净。 (4)关闭泄压阀，纯甲醇冲洗半小时即可。

14. 故障2    柱压高 • 原因 (1) 缓冲液盐分如(乙酸铵等) 沉积于柱内 (2) 样品污染沉积。

15. 处理办法 (1) 对于第一种情况先用40～50 ℃的纯水，低速正向冲洗柱子，待柱压逐渐下降后，相应提高流速冲洗，柱压大幅度下降后，用常温纯水冲洗，之后用纯甲醇冲洗柱子30 分钟。 (2) 对于第二种情况，由样品的沉积引起污染的C18柱，和纯水反向冲洗柱子，然后换成甲醇冲洗，接着用甲醇+ 异丙醇(4 + 6) 冲洗柱子(冲洗时间的长短由样品污染的情况而定)，再用换成甲醇冲洗, 然后用纯水冲洗，最后甲醇冲洗正向冲洗柱子30 分钟以上。

16. 故障3   既无压力指示,又无液体流过 • 原因 (1) 泵密封垫圈磨损 (2) 大量气泡进入泵体。 处理办法 对于第一种情况,更换密封垫圈 对于第二种情况,在泵作用的同时, 用一个50ml 的玻璃针筒在泵的出口处帮助抽出空气。

17. 故障4    压力波动大,流量不稳定 原因 系统中有空气或者单向阀的宝石球和阀 座之间夹有异物,使得两者不能密封。 • 处理办法 工作中注意观察流动相的量, 保证不锈钢滤器沉入储液器瓶底,避免吸入空气,流动相要充分脱气。 如为单向阀和阀座之间夹有异物, 拆下单向阀, 放入盛有丙酮的烧杯用超声波清洗.

18. 故障5    出峰不佳，峰分叉 • 原因(1) 色谱柱被污染 (2) 柱头填料塌陷。

19. 处理办法 • 对于第一种情况，先用纯水反向冲洗柱子，然后换成甲醇冲洗，接着用甲醇+ 异丙醇(4 + 6) 冲洗柱子(冲洗时间的长短由样品污染的情况而定)，再换成甲醇冲洗，然后用纯水冲洗，最后甲醇冲洗正向冲洗柱子30 分钟以上。 如冲洗后依然出峰不佳，则考虑第二种情况。 • 对于第二种情况，拧开柱头，检查柱填料是否硬结或塌陷。去除硬结部分(污染的填料)，装入新填料，滴一滴甲醇，填料下陷，再填，用与柱内径相同的顶端平滑的不锈钢杆压紧，再填平，滴甲醇，再压紧反复几次，直至装满填平。 柱头用甲醇冲洗干净，擦净柱外壁的填料，拧紧柱头，用纯甲醇冲洗30 分钟以上。

20. 故障6   峰面积重复性不佳。 • 原因 (1) 进样阀漏液 (2) 加样针不到位

21. 处理办法 • 对于第一种情况更换进样阀垫圈 (2) 对于第二种情况保证加样针插到底，注射样品溶液后须快速、平稳地从LOAD 状态转换到INJECT状态，以保证进样量的准确。

22. 使用注意事项 • 注意不要让空气进入输液系统和高压泵中 • 储液器内的溶液如长时间未用，应清洗储液器并更换溶液。 • 每次用完色谱仪后缓冲液要用纯水冲洗干净，防止无机盐析出或沉积。 • 样品的前处理也很重要,任何样品都要尽可能地去除杂质，完全溶解，尽量减少对色谱柱的污染，以延长色谱柱的使用寿命，同时避免注射过浓的样品溶液，以免残留液在进样阀内析出固体引起堵塞。 • 色谱柱作好标记，用于不同分析目的的色谱柱不要混用等。

23. HPLC使用问答 • 问：用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原因何在?如何解决? • 答：关于漂移问题： • 1温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定 • 2流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等 • 3柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡

24. 关于快速变化问题  • 1流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定 • 2泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。 • 3流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合

25. 问：液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么?问：液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么? • 答：1筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。 • 2存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子

26. 问：HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法 • 答：1样品量不足：解决办法为增加样品量 • 2样品未从柱子中流出：可根据样品的化学性质改变流动相或柱子 • 3样品与检测器不匹配：根据样品化学性质调整波长或改换检测器 • 4检测器衰减太多：调整衰减即可。 • 5检测器时间常数太大：解决办法为降低时间参数 • 6检测器池窗污染：解决办法为清洗池窗。 • 7检测池中有气泡：解决办法为排气。 • 8记录仪测压范围不当：调整电压范围即可。 • 9流动相流量不合适：调整流速即可。 • 10检测器与记录仪超出校正曲线：解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。

27. 问：做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在?如何解决?问：做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在?如何解决? • 答：原因可能有： • 1泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理； • 2比例阀失效，更换比例阀即可。 • 3泵密封垫损坏，更换密封垫即可。 • 4溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法； • 5系统检漏，找出漏点，密封即可。 • 6梯度洗脱，这时压力波动是正常的。

28. 问：我购买的HPLC柱验收测试时柱压过高，请问为什么?问：我购买的HPLC柱验收测试时柱压过高，请问为什么? • 答：柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。 • 1拆去保护柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；2把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查。 • 3将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子，(此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动性)。这时，如果柱压仍不下降，再检查；      • 4更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明你的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与厂商联系。一般情况下，在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题，SGE提供的Rheodyne 7315型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。

29. TRACE GC ultra 气相色谱仪

30. 工作原理 • 利用混和物在固定相和流动相之间各组分的分配系数不同，达到分离和鉴定的目的。 • 利用试样中各组份在气相和固定液液相间的分配系数不同，当汽化后的试样被载气带入色谱柱中运行时，组份就在其中的两相间进行反复多次分配。 • 由于固定相对各组份的吸附或溶解能力不同， 因此各组份在色谱柱中的运行速度就不同，经过一定的柱长后，便彼此分离，按顺序离开色谱柱进入检测器，产生的离子流讯号经放大后，在记录器上描绘出各组份的色谱峰。

31. 仪器组成（主要技术参数） 主要由气路系统和载气系统组成 （1）载气系统 包括气源、气体净化、气体流速控制和测量 （2）进样系统 包括进样器、汽化室（将液体样品瞬间汽化为蒸气） （3）色谱柱和柱温 包括恒温控制装置（将多组分样品分离为单个） （4）检测系统 包括检测器，控温装置（ FID、ECD、FPD检测器 ） （5）记录系统 包括放大器、记录仪、或数据处理装置、工作站  

32. 主要用途 • 气体及沸点较低且热稳定性好的物质的分离和测定。 • 适用于化工、食品、生物、医药、环保等各个学科领域 • 气相色谱法在生物科学和医学上的应用 气相色谱法鉴定厌氧菌 气相色谱法分析细菌在体外培养物中的代谢产物 临床标本中细菌和检出和鉴定 气相色谱法分析细菌细胞成分 用血培养物的气相色谱法推测诊断厌氧菌菌血症 气相色谱法快速诊断脑膜炎 用细胞脂肪酸和酮酸鉴定无色杆菌

33. 使用注意事项 • 样品处理： • 自备试剂： • 结果分析：

34. 气相色谱使用注意事项 • 主要是进样问题 手不要拿注射器的针头和有样品部位、不要有气泡（吸样时要慢、快速排出再慢吸，反复几次，10ul注射器 金属针头部分体积0.6ul，有气泡也看不到，多吸1-2ul把注射器针尖朝上气泡上走到顶部再推动针杆排除气泡，（指10ul注射器，带芯子注射器平感觉）进样速度要快（但不易特快），每次进样保持相同速度，针尖到汽化室中部开始注射样品。

35. 气相色谱-质谱联用分析技术

36. 气相色谱分离操作条件的选择 柱温的选择 截气的选择 进样条件的选择

37. 常见故障 • 气路系统故障的原因一般是漏气，气体质量不达标，气体稳压、稳流差等。 • 基线若始终向下漂移，即“电平”值逐渐变小至负数，这极有可能是载气泄漏，那么就要查找各个接头部件是否泄漏；若不泄漏而基线仍漂移，则可能是电路系统的故障。 • 电路系统的故障，一般是温度控制系统的故障和检测放大系统的故障，首先检查可控硅、加热丝、铂电阻是断路、短路或是接触不良。其次检查辅回路的其它电子部件。放大系统常见故障是离子讯号线受潮或断开、高阻开关（即灵敏度选择）受潮、集成运算放大器（如：AD515JH、OP07等）性能变差或坏等。 • 若出现基线不停的抖动或基线噪音很大时，可先将放大器的讯号输入线断开，观察基线情况，如果恢复正常，则说明故障不在放大器和处理机（或记录仪），而在气路部分或温度控制单元；反之，则说明故障发生在放大器、记录仪（或处理机）等单元上。

38. 原子吸收分光光度计

39. 、基本原理  原子吸收光谱仪的基本原理是将待测物中所含之元素原子化，原子再吸收由中空阴极射线管所放出之特定波长的光谱，通过测定其吸光度来换算出样品元素浓度。、基本原理  原子吸收光谱仪的基本原理是将待测物中所含之元素原子化，原子再吸收由中空阴极射线管所放出之特定波长的光谱，通过测定其吸光度来换算出样品元素浓度。

40. 5.2原子吸收分光光度计 5.2.1分类及特点 5.2.2光源系统 5.2.3原子化系统 5.2.4分光系统 5.2.5检测系统 上节 返回章 下节

41. 原子吸收分光光度计 5.2.1仪器分类及特点 1.分类: (1)单光束; (2)双光束. ①单道双光束; ②多道双光束. 多数仪器还具火焰光度分析功能. 休息

42. 5.2.1仪器分类及特点 单道双光束原子吸收分光光度计:

43. 5.2.1仪器分类及特点 单道双光束仪器流程示意图: 光源 吸收 分光 检测

44. 5.2.1仪器分类及特点 2.特点: 与一般分光光度计相似,不同之处有: ①光源不是连续光源,而是锐线光源; ②分光系统处于火焰与检测器之间,避免火焰辐射对检测以及检测器的影响; ③为了区分有用信号与背景信号(火焰发射),仪器采用调制式工作方式. 休息 返回节

45. 空心阴极灯 5.2.2光源系统 主要作用: 辐射出待测元素的特征谱线,并保证光源能稳定工作. 1.空心阴极灯基本结构: 低压惰性气体 阳极 光学窗口 空心阴极 休息

46. 5.2.2光源系统 2.空心阴极灯工作原理: 辉光放电 电子与惰性气体碰撞 离子将阴极内壁表面原子轰击出来 碰撞激发 用不同待测元素作阴极材料就可制成相应空心阴极灯. 休息

47. 5.2.2光源系统 3.辐射强度与灯电流: 增大I灯可增大辐射强度. 若灯电流过大,则会加剧多普勒变宽,而且还可能导致自吸变宽; 若灯电流过小,不仅光强弱,而且稳定性、信噪比下降 . 休息 返回节

48. 5.2.3原子化系统 主要作用: 将试液或固体样品中的待测元素转化为原子蒸气. 1.原子化方式与主要特点: (1)火焰原子化; (2)无火焰原子化. ①原子化条件稳定; ②原子化效率低 ①原子化效率高; ②精密度差. 2.火焰原子化: 休息

49. 5.2.3原子化系统 以火焰为能源的原子化方式. 试样雾滴在火焰中,经蒸发-干燥-离解(还原)等过程产生基态原子. 火焰原子化器类型: ①直接注入式(全消耗型); ②预混合式(型). (1)预混合型原子化器基本结构与工作原理: 构成: 休息

50. 5.2.3原子化系统 ①雾化器; ②雾化室; ③燃烧器. 长缝型喷灯 (燃烧器) 燃烧器 雾化室 同轴型 气动雾化器 休息