Download
1 / 264
2.83k likes | 3.28k Views
Biochimia proteinelor. Selenocisteina. Selenocisteina este un aminoacid neobişnuit prezent în câteva enzime fiind util pentru activitatea lor
E N D
Selenocisteina • Selenocisteina este un aminoacid neobişnuit prezent în câteva enzime fiind util pentru activitatea lor • Nu este sintetizat ca urmare a prelucrărilor posttranslaţionale. O modificare a serinei apare când aceasta se leagă la tARN-ul unic, formând selenocisteinil-ARNt. Selenocisteina este ulterior inserată într-o proteină cu care va fi sintetizată.
Proteine • Proteinele sunt substanţe azotate complexeprezente în toate celulele animale sau vegetale • Roluri: • 1. structural- arhitectura celulară • 2. funcţional- enzime, hormoni, receptori, represori, contractil, transport gaze sangvine, coagulare • 3. fizico-chimic- menţinerea presiunii osmotice şi a echilibrului acido-bazic • 4. energetic- proteine de rezervă (caseina, ovalbumina pentru creşterea embrionului) sau eliberare de energie (4,5kcal/g proteine oxidate)
Structura primară a proteinelor • Unicitatea proteinelor este dictată de secvenţa lineară de aminoacizi, denumită structură primară.
Structura primară a proteinelor • Numărul proteinelor a căror structură primară se cunoaşte este de ordinul zecilor de mii. Insulina (51 aminoacizi), ribonucleaza (124 aminoacizi), hemoglobina (catenele α cu 141 aminoacizi, cele β cu 146 aminoacizi), mioglobina (453 aminoacizi), citocromul c (204 aminoacizi), gamaglobulina (1320 aminoacizi) • Structura proteică primară determină gradul de pliere şi modul de interacţiune cu alte molecule intracelulare astfel încât proteina să-şi poată exercita funcţia. Structurile primare ale tuturor proteinelor sunt sintetizate pornind de la cei 20 aminoacizi care se succed într-o secvenţă lineară determinată de codul genetic.
Structura primară a proteinelor • Codul genetic este secvenţa de trei baze (nucleotide) din ADN, conţinând informaţia secvenţei lineare de aminoacizi din lanţul polipeptidic (structura primară) • O genă este porţiunea din ADN care codează produsul funcţional precum lanţul polipeptidic. Mutaţiile care sunt modificări în nucleotidele genei determină alterareaprodusului codificat de genă.
Structura primară a proteinelor • La nivelul ribozomilor se realizează translaţia informaţiei genetice de la ARNm în lanţul polipeptidic • În nucleu, ARNm copiază informaţia genetică de la ADN nuclear iar apoi migrează în citoplasmă. Fiecare moleculă de ARNt posedă la mijlocul lanţului său un anticodon a căror 3 baze consecutive se pot asocia prin legături de hidrogen cu 3 baze complementare de un codon ARNm. Pe baza acestui anticodon aminoacizii vor fi poziţionaţi conform mesajului genetic din ARNm. Această poziţionare a aminoacil-ARNt se realizează la suprafaţa ribozomului la nivelul a două situsuri stereospecifice: situl "P" (peptidil) şi situl "A" (aminoacil), situate la suprafața subunităţilor.
Structura primară a proteinelor • Substituţia unui singur aminoacid modifică funcţia proteinei sau conferă un avantaj specific unui anumit ţesut sau unui set de circumstanţe. Multe proteine precum hemoglobina pot prezenta polimorfisme sau variante genetice ale structurii primare • La acelaşi individ, structura primară a proteinelor diferă în funcţie de stadiul de dezvoltare, fiind prezentă ca izoforme fetale şi adulte ca în cazul hemoglobinei. Structura primară a creatin-kinazei variază în funcţie de ţesut (izoforme specific tisulare) sau în cadrul aceluiaşi ţesut, în funcţie de localizarea intracelulară. Separarea electroforetică a izoenzimelor tisular-specifice este utilă în localizarea injuriei tisulare
Structura primară a proteinelor • Înafara aminoacizilor codificaţi genetic şi care formează structura primară, mai există şi aminoacizi specifici modificaţi prin fosforilare, oxidare, carboxilare sau prin alte tipuri de reacţii • Când aceste reacţii sunt catalizate enzimatic, modificările sunt denumite post-translaţionale.
Structura primară a proteinelor • Proteinele sunt polipeptide rezultate prin condensarea AA, cu eliminarea unei molecule de apă între gruparea –COOH a unui AA şi gruparea –NH2 a AA următor
Structura primară a proteinelor • Secvenţa AA într-un lanţ polipeptidic: • de la capătul N-terminal spre C-terminal
Structura primară a proteinelor • Stabilireasecvenţei de AA dintr-un lanţ polipeptidic: prinmetodechimicesauenzimatice- “TRADIŢIONALE” • Etape: • 1. Determinarea AA de la capetele N- ;C-terminale • 2. Stabilireasecvenţei de AA din interiorul lanţului pp • 3. Separarea lanţurilor în cazul proteinelor oligomere, urmată de parcurgerea primelor etape
Structura primară a proteinelor • Prima etapă în stabilirea structurii primare a unui polipeptid constă în identificarea şi cuantificarea aminoacizilor constituienţi. • O probă purificată din polipeptidul de analizat este iniţial hidrolizată prin tratare cu un acid tare la 110ºC timp de 24ore • Această procedură induce clivarea legăturilor peptidice şi separarea aminoacizilor individuali care pot fi detectaţi cu ajutorul cromatografiei prin schimbionic.
Structura primară a proteinelor • În cadrul acestei metode, amestecul de aminoacizi este plasat într-o coloană formată din granulele unei răşini sintetice care conţine grupări electronegative. • Aminoacizii din amestec aderă la coloană cu afinităţi diferite, în funcţie de încărcarea electrică, caracterul hidrofob, etc. • Prin creşterea treptată a pH-ului şi a concentraţiei ionice în soluţiile apoase eluante, aminoacizii migrează în coloană cu viteze diferite, iar eluantul este colectat în fracţii mici. • .
Structura primară a proteinelor • Aceste fracţiuni care conţin aminoacizi sunt analizate cantitativ cu ajutorul reacţiei cu ninhidrină, un reactant care prin încălzire reacţionează cu majoritatea aminoacizilor, cu amoniacul, cu aminele şi formează compuşi roşu-violet • Determinarea cantitativă a fiecărui aminoacid se realizează prin spectrofotometrie, care măsoară cantitatea de lumină absorbită de derivatul ninidrinic. Procedura descrisă se realizează cu ajutorul analizorului de aminoacizi.
Structura primară a proteinelor • Determinarea secvenţei de aminoacizi a peptidelor • Secvenţierea reprezintă un proces etapizat de identificare a aminoacizilor constituienţi ai unui lanţ peptidic începând de la capătul N-terminal al acestuia. Fenilizotiocianatul, cunoscut şi ca reactiv Edman, reacţionează cu gruparea amino terminală a peptidului în condiţii de pH uşor alcalin • Rezultă un derivat feniltiohidantoinic care produce instabilitatea legăturii peptidice la capătul N-terminal, iar aceasta poate fi hidrolizată selectiv, fără clivarea celorlalte legături peptidice.
Structura primară a proteinelor Derivatul aminoacidic rezultat poate fi separat şi identificat ulterior
Structura primară a proteinelor • Avantajul metodei este că restul lanţului peptidic rămâne intact după îndepărtarea aminoacidului N-terminal, iar reactivul Edman este utilizat în mod repetat asupra lanţului peptidic scurtat în urma testării anterioare până la identificarea tuturor resturilor de aminoacizi • Prin degradarea Edman se poate identifica o secvenţă de pînă la 30 aminoacizi, cu o eficienţă de 98%/aminoacid. Un alt avantaj ar fi cantitatea de numai 10-100 picomoli de peptidă necesari pentru determinare.
Structura primară a proteinelor • Clivarea lanţurilor polipeptidice în fragmente mai mici • Numeroase polipeptide au o structură primară alcătuită din peste 100 de aminoacizi. Astfel de molecule nu pot fi secvenţiate direct, de la un capăt la celălat. În schimb, aceste molecule mari sunt clivate în anumite locuri cu secvenţierea ulterioară a fragmentelor rezultate • Se pot folosi doi sau mai mulţi agenţi de clivare
Structura primară a proteinelor • Metode de analiză cu enzime: • 1. Bromura de cianogen scindează lanţul pp: Met-X • 2. Etilamina: transformă cisteina în aminoetil-cisteină • 3. Tripsina scindează şi legăturile Cys- X • 4. Tripsina: Lys-X, Arg-X • 5. Chimotripsina: Phe-X, Tyr-X, Trp-X • 6. Carboxipeptidazele: X-Phe, X-Lys
Structura primară a proteinelor • După scindareaproteinei cu obţinerea mai multor peptide mai mici se definitivează succesiunea lor utilizând tehnica peptidelor suprapuse • Lanţul polipeptidic iniţial se scindează prin metode diferite, iar prin compararea seturilor de peptide obţinute se stabileşte integral secvenţa iniţială
Structura primară a proteinelor • Tripsina: Glu-Met-Leu-Gly-Arg • Val- Tyr-Lys • Ala-Ser-Asp • BrCN: Leu-Gly-Arg-Ala-Ser-Asp • Val-Tyr-Lys-Glu-Met • Secvenţa finală??????
Structura primară a proteinelor • Val- Tyr-Lys-Glu-Met-Leu-Gly-Arg-Ala-Ser-Asp
Structura primară a proteinelor • Determinarea structurii primare a unei proteine prin secvenţiere ADN • Secvenţierea nucleotidelor dintr-o regiune ADN codificatoare a proteinelor identifică secvenţa de aminoacizi a unui polipeptid • Dacă secvenţa de nucleotide este stabilită, pe baza informaţiilor referitoare la codul genetic are loc traducerea secvenţei de nucleotide în secvenţa de aminoacizi corespunzătoare polipeptidului studiat.
Structura primară a proteinelor • Determinarea structurii primare a unei proteine prin secvenţiere ADN • Acest procedeu, deşi utilizat de rutină pentru a preciza secvenţa de aminoacizi din componenta proteinelor, este limitat de faptul că nu poate preciza poziţiile legăturilor disulfidice la nivelul lanţurilor pliate, precum şi de faptul că nu identifică aminoacizii cu modificări post-translaţionale • Secvenţierea directă a proteinelor constituie un instrument important în stabilirea exactă a structurii primare.
Variaţii ale structurii primare • Deşi aproape fiecare aminoacid din structura proteică primară contribuie la realizarea conformaţiei sale (structura tridimensională), structura primară a proteinei diferă în funcţie de specie. • În cadrul aceleiaşi specii există diferenţe ale secveţei de aminoacizi la nivelul individului, în funcţie de ţesut sau de stadiul de dezvoltare. Aceste diferenţe ale proteinelor funcţionale sunt tolerate în măsura în care aparţin unor regiuni „necritice” denumite variabile, dacă sunt substituţii conservative (înlocuirea unui aminoacid cu altul de structură similară) sau îi conferă un avantaj • Dacă mai mulţi aminoacizi sunt toleraţi în aceeaşi poziţie, regiunea este denumită hipervariabilă.
Variaţii ale structurii primare • În contrast, regiunile care formează situsuri de legare sau sunt critice în formarea structurii tridimensionale funcţionale sunt frecvent invariabile şi au exact aceeaşi secvenţă de aminoacizi la toţi indivizii, ţesuturile sau speciile • Polimorfismul în structura proteinelor • La nivelul populaţiei umane, structura primară a proteinei ar putea să difere puţin interindividual. Variaţiile apar din mutaţiile ADN transmise generaţiei următoare. Mutaţiile pot fi punctiforme şi rezultă prin substituţia unei baze în secvenţa de ADN sau sunt deleţii/ inserţii de baze.
Polimorfismul în structura proteinelor • Pentru majoritatea alelelor, aceste schimbări au consecinţe fenotipice distincte determinând disfuncţii obiective ( boli congenitale sau genetice) sau creşteri ale susceptibilităţii pentru anumite boli • O proteină defectivă diferă de majoritatea alelelor printr-un singur aminoacid care reprezintă o substituţie nonconservativă (înlocuirea unui aminoacid cu altul de polaritate diferită sau de mărime diferită) într-o regiune invariabilă • Asemenea mutaţii ar putea afecta capacitatea proteinelor de a-şi exercita funcţia, de a cataliza o anumită reacţie. Pentru alte proteine variaţiile nu au semnificaţie.
Polimorfismul în structura proteinelor • Variantele unei alele care apar cu o frecvenţă semnificativă în populaţie sunt considerate polimorfisme • Când acea variaţie a unei alele creşte în populaţie la o frecvenţă de 1% este considerată stabilă • Siclemia este un exemplu de mutaţie punctiformă stabilă în populaţia umană. Persistenţa sa este probabil atribuită presiunii selective asupra fenotipului mutant heterozigot ce conferă o anumită protecţie în malarie.
Exemple • 1. WS este un băiat de 17 ani care s-a prezentat în urgenţă cu dureri lombare severe, dureri abdominale şi ale membrelor care au debutat după două zile de greţuri şi vărsături cauzate de gastroenterită • La vârsta de 3 ani a fost diagnosticat cu siclemie şi a fost internat de nenumărate ori pentru asemenea episoade
Exemple • La internare: • nivelul Hg serice a fost 7,8 g/dL (IBR: 12-16g/dL); • Ht era 23,4% (IBR: 41-53%); • Bil serică totală (un pigment ce rezultă din degradarea Hb) era 2,3 mg/dL (IBR: 0,2-1 mg/dL) • Radiografia abdominală a evidenţiat calculi radiopaci în vezica biliară.
Exemple • Din cauza hemolizei cronice (distrucţia hematiilor) cantitatea de hem degradată la bilirubină este crescută. Calculii sunt rezultatul excreţiei unei cantităţi crescute de bilirubină din ficat în bilă cu formarea depozitelor de cristale de bilirubinat în lumenul vezicii biliare • Termenul de „calcul” este folosit pentru a descrie orice depunere anormală ca un precipitat a sărurilor minerale. Aproape întotdeauna se formează în organele cavitare (rinichi) sau în lumenul unor ducte (duct biliar comun).
Exemple • Pacientul are siclemie produsă de o mutaţie punctiformă a a ADN care modifică al 6-lea aminoacid din lanţul globinic β al hemoglobinei prin care glutamatul este înlocuit cu valina • Ce diferenţe apar în modul de realizare a legăturilor chimice în cazul celor doi aminoacizi?
Exemple • Glutamatulprezintă la pH-ul fiziologic o sarcină negativă în radical stabilind legături ionice sau de hidrogen cu apa sau cu alte catene laterale. Valina este un aminoacid hidrofobic ce tinde să interacţioneze cu ale lanţuri hidrofobice pentru a exclude apa, modificânduse structura cuaternară • Înlocuirea glutamatului cu valina în lanţul β permite separarea HbS de Hb adultă normală prin electroforeză. În acest caz, pacienta era homozigotă pentru HbS şi avea o cantitate crescută de Hb fetală, HbF. Heterozigoţii pentru HbS prezintă atât HbA cât şi HbS, precum şi cantităţi mici de HbF
Exemple • La indivizii heterozigoţi pentru siclemie, alela celulei S oferă o oarecare protecţie împotriva malariei, boală cauzată de Plasmodium falciparum care îşi petrece o parte din ciclul de viaţă în hematie • Hematia infectată la indivizii cu Hb adultă normală dezvoltă protruzii care se ataşează la endoteliul capilar. Această legare blochează vasele şi oxigenul nu mai ajunge în regiunea afectată, rezultând moartea celulară • La heterozigoţi, HbS în celulele afectate se adună în fibre lungi, care determină distorsionarea celulei. Aceste celule distorsionate conţinând parazitul sunt recunoscute preferenţial de splină şi sunt rapid distruse, încetând viaţa parazitului.
