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Genômica Funcional. Genômica - Histórico. 1977 – Técnica de seqüenciamento de DNA – Método de Sanger 1991 – Projeto Genoma Humano 1995 – Primeiro genoma sequenciado ( Haemophylus influenzae ) 2001 – Primeiro rascunho do Genoma Humano 2003 – Conclusão do seqüenciamento do Genoma Humano
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Genômica - Histórico • 1977 – Técnica de seqüenciamento de DNA – Método de Sanger • 1991 – Projeto Genoma Humano • 1995 – Primeiro genoma sequenciado (Haemophylus influenzae) • 2001 – Primeiro rascunho do Genoma Humano • 2003 – Conclusão do seqüenciamento do Genoma Humano • 2009 – Mais de 998 genomas bacterianos seqüenciados • 23 genomas de eucariotos completos 189 montados • 1060 genomas bacterianos montados – falta a anotação • 1012 em andamento
Haemophilus influeanzae Fleischmann et al., Science 269:496-512, 1995
Science, July 28, 1995 v269 n5223 p496(17) Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd. (first genome of free-living organism ever completely sequenced. Robert D. Fleischmann; Mark D. Adams; Owen White; Rebecca A. Clayton; Ewen F. Kirkness; Anthony R. Kerlavage; Carol J. Bult; Jean-Fracois Tomb; Brian A. Dougherty; Joseph M. Merrick; Keith McKenney; Granger Sutton; Will FitzHugh; Chris Fields; Jeannine D. Gocayne; John Scott; Robert Shirley; Li-Ing Liu; Anna Glodek; Jenny M. Kelley; Janice F. Weidman; Cheryl A. Phillips; Tracy Spriggs; Eva Hedblom; Matthew D. Cotton; Teresa R. Utterback; Michael C. Hanna; David T. Nguyen; Deborah M. Saudek; Rhonda C. Brandon; Leah D. Fine; Janice L. Fritchman; Joyce L. Fuhrmann; N.S.M. Geoghagen; Cheryl L. Gnehm; Lisa A. McDonald; Keith V. Small; Claire M. Fraser; Hamilton O. Smith; J. Craig Venter. ABSTRACT An approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1,830,137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd. This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable. The H. influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism.
Transcriptoma É o conjunto de mRNA transcritos por um determinado tecido ou célula. Estuda-se o transcriptoma pela técnica de microarranjo (Microarray)
Microarray Data Analysis • A simple concept: Dot Blot + Northern • Reverse the hybridization - put the probes on the filter and label the bulk RNA • Make probes for lots of genes - a massively parallel experiment • Make it tiny so you don’t need so much RNA from your experimental cells • Make quantitative measurements
cDNA Microarray Technologies • Spot cloned cDNAs onto a glass microscope slide • usually PCR amplified segments of plasmids • Label 2 RNA samples with 2 different colors of fluorescent dye - control vs. experimental • Mix two labeled RNAs and hybridize to the chip • Make two scans - one for each color • Combine the images to calculate ratios of amounts of each RNA that bind to each spot
Chip Spoter Robot spotter
Microarray analysis Operation Principle: Samples are tagged with flourescent material to show pattern of sample-probe interaction (hybridization) Microarray may have 100K probe
Microarray Processing sequence From: Shin-Mu Tseng tsengsm@mail.ncku.edu.tw
DNA Chip Microarrays • Put a large number (~100K) of cDNA sequences or synthetic DNA oligomers onto a glass slide (or other substrate) in known locations on a grid. • Label the DNA sample and hybridize • Measure amounts of DNA bound to each square in the grid • Make comparisons • Cancerous vs. normal tissue • Treated vs. untreated • Many applications in both basic and clinical research
O que é Proteômica? • É a identificação, caracterização e quantificação de todas as proteínas envolvidas em uma rota metabólica, organela, célula, tecido, orgão, ou organismo, que pode ser estudado em conjunto para fornecer dados precisos e compreensivos sobre aquele sistema.
Análise de Imagens para Expressãodiferencial de proteínas Controle acid base • Scanearimagem dos géis. Importarimagens no software PDQuest. • Remover Ruído.Ruído de fundo, artefatos, e riscossãoremovidos para umacomparaçãomaisprecisa. • Alinhamento das imagens. Os géissãoalinhadosapósdefinirproteínas de referência em cada gel. • Detecção e quantificação. Spots sãodetectados e analisadosapósnormalização com proteínas “housekeeping” presentes no gel. • Proteínasexpressasdiferentemente.Aumentooudiminuição de pelomenos 2 X entre gel de tratamento e controle. Mr pI Tratamento acid base Mr pI
Identificação das proteínas • Proteínasdiferentementeexpressassãoexcisadas do gel 2D e digeridas com tripsina. Os peptídeosresultantessãoanalisadosporEspectrometria de Massa (MS) • O MALDI-TOF MSfornece um “peptide fingerprint” da proteína, usando a massacorrespndente de cadapeptídeo.
MALDI-TOF-MS Matrix-Associated Laser Desorption Ionization Time of Flight MALDI-TOF determina o tempo que partículas (i.e. peptídeos) levam para transitar uma distância específica após serem “desalojadas” de uma superfície por uma quantidade de energia específica, para determinar o peso molecular com precisão.
Busca em banco de dados usando os dados do MALDI-TOF para identificação da proteína • Proteínas são identificadads inserindo a massa dos peptídeos em um banco de dados de peptídeos como o ProFound. • Parâmetros de busca são refinados incluindo massa e ponto isoelétrico determinados por 2D PAGE. • http://www.unb.br/cbsp/paginiciais/profound.htm
MALDI/TOF/TOF-MS/MS Análise proteômica de proteínas antigênicas de M. hyopneumoniae • Imunoblot das proteínas separadas por 2D com soros de suínos imunizados ou doentes. • Identificação das proteínas antigênicas por espectrometria de massa. 2D Imunoblot
Análise proteômica de M. hyopneumoniae • Análise comparativa dos perfis de eletroforese bidimensional das cepas 7448 e J de M. hyopneumoniae; • Identificação das proteínas de M. hyopneumoniae resolvidas por eletroforese bidimensional por espectrometria de massa; • Identificação de proteínas de caráter antigênico.
