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Magíster T.M. Juan Luis Castillo Navarrete

Another YCP controversy: Membrane Potential influence with Clinical index and Bismuth Subcitrate Rol in some Chileans Study. Flow Cytometry viability analisys and Real Clinical Impact from this new way to evaluate Bismuth antibacterian actions.

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Magíster T.M. Juan Luis Castillo Navarrete

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  1. Another YCP controversy:Membrane Potential influence with Clinical index and Bismuth Subcitrate Rol in some Chileans Study. Flow Cytometry viability analisys and Real Clinical Impact from this new way to evaluate Bismuth antibacterian actions. • Correlation between Flow Cytometry in the evaluation of Membrane Potential and Cellular Viability from HP • And Actual Rol from Bismuth Subcitrate in relation to the membrane equilibrium and Clinical Impact

  2. Departamento de Microbiología Facultad de Ciencias Biológicas Universidad de Concepción CITOMETRÍA DE FLUJO EN LA EVALUACIÓN DE POTENCIAL DE MEMBRANA Y VIABILIDAD CELULAR DE Helicobacter pylori. Magíster T.M. Juan Luis Castillo Navarrete

  3. Título Citometría de flujo en la evaluación de potencial de membrana y viabilidad celular de Helicobacter pylori. • Magister Juan Luis Castillo, Dra Apolinaria Garcia, Dr, Fernando Kawaguchi, Dr Carlos Gonzalez, Dr Jaime Madariaga, Sr, Ignacio Alfaro, Tamara Perez, Cinthya Perez. • Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Concepción. • Laboratorio de Citometría de Flujo, Hospital del Trabajador Concepción.

  4. Helicobacter pylori Patógeno gastroduodenal humano Hábitat Mucosa gástrica pH óptimo Agente etiológico: 6.0 - 7.0 (neutrófila) • Enfermedad péptica ulcerosa • Dispepsia no ulcerosa • Gastritis crónica superficial • Linfoma MALT Ureasa Crecimiento a pH < 4.5 Gastroenterology 1992: 102;720-727

  5. Helicobacter pylori Estómago Capacidad de generar potencial bioenergético • Viabilidad • Crecimiento • Proliferación Potencial de membrana

  6. Gradiente electroquímico de protones (membrana interna) Bacterias aeróbicas • Egreso de protones • Ingreso de electrones Fuerza protón motriz Ingreso / Egreso de solutos Gradiente eléctrico Potencial de membrana Interior negativo -100 a -200 mV J Exp Biol 2000:203;51-59 Antimicrob Agents Chemother 2000:44;827-834 Cytometry 1999:35;55-63 / 2001:43;223-226

  7. Autolisis bacteriana • Transporte de glucosa • Quimiotaxis Potencial de membrana Involucrado Disminución Aumento Hiperpolarización Depolarización Se reduce a cero Ionóforos J Exp Biol 2000:203;51-59 Antimicrob Agents Chemother 2000:44;827-834 Cytometry 1999:35;55-63 / 2001:43;223-226

  8. Sustancias fluorescentes / vitales Indicador de viabilidad celular Impermeabilidad membrana celular • Compuestos orgánicos con al menos 2 cargas (+) • Compuestos cargados negativamente Excluidos por membranas celulares intactas (eucariontes y procariontes) Letter Appl Microbiol 2002:34;1-7 FEMS Microbiol Rev 2000:24;429-448 Antimicrob Agents Chemother 2000:44;827-834 Cytometry 1999:35;55-63 / 2001:43;223-226

  9. Membrana Celular Impermeabilidad de la membrana a ciertas sustancias Potencial de membrana Indicador de estado fisiológico de la membrana Viabilidad celular Letter Appl Microbiol 2002:34;1-7 FEMS Microbiol Rev 2000:24;429-448 Antimicrob Agents Chemother 2000:44;827-834 Cytometry 1999:35;55-63 / 2001:43;223-226

  10. Permeabilidad membrana celular Indicador de muerte celular Compuestos fluorescentes que se unen a ácidos nucleicos • Propidium iodado (PI) • TO-PRO-3 • TO-PRO-1 • Sytox Green • Bromuro de etidio PI Viabilidad celular Letter Appl Microbiol 2002:34;1-7 FEMS Microbiol Rev 2000:24;429-448 Antimicrob Agents Chemother 2000:44;827-834 Cytometry 1999:35;55-63 / 2001:43;223-226

  11. Potencial de membrana Eucariontes Microelectrodos Cationes lipofílicos radiomarcados Procariontes Citometría de Flujo Valor promedio de suspensión celular completa Bacterias en crecimiento activo J Exp Biol 2000:203;51-59 Antimicrob Agents Chemother 2000:44;827-834 Cytometry 1999:35;55-63 / 2001:43;223-226

  12. Compuestos para ensayos Potenciométricos Carbocianinas (slow response probes) • Fluorescencia verde: • Se altera con el tamaño celular y • presencia de agregados. • Es independiente del PM • Fluorescencia roja: • Dependiente del tamaño y del PM DiOC2(3) (488 nm) • Razón F. roja / F. verde: • Medida de PM • Independiente del tamaño Potencial de Membrana: Indicador confiable de muerte celular DiOC2(3): (3,3´-dietiloxacarbocianina iodada Antimicrob Agents Chemother 2000:44;827-834 Cytometry 1999:35;55-63 / 2001:43;223-226 Handbook of fluorescent probes, 2002. (www.probes.com)

  13. Objetivos Generales Determinar por citometría de flujo, los parámetros de tamaño, forma celular, viabilidad celular y potencial de membrana en bacterias. Determinar el efecto que ejercen sobre el potencial de membrana y la viabilidad celular de H. pylori, diversas sustancias que tienen acción contra esta bacteria.

  14. Objetivos específicos Determinar, mediante citometría de flujo, los parámetros de tamaño, forma, viabilidad celular y potencial demembrana, en E. coli y S. aureus. Determinar, mediante citometría de flujo, los parámetros de tamaño, forma, viabilidad celular y potencial de membrana, en H. pylori. Evaluar el efecto de agentes antibacterianos usados comúnmente en el tratamiento de erradicación de H. pylori, sobre el potencial de membrana y viabilidad celular de H. pylori.

  15. Hipótesis Mediante citometría de flujo, es posible determinar los parámetros de tamaño, forma celular, potencial de membrana y viabilidad celular en Helicobacter pylori. Los diversos agentes antibacterianos utilizados en el tratamiento de la infección por Helicobacter pylori, producen alteraciones en la células bacteriana, tanto de tamaño, morfología, como también en el potencial de membrana y viabilidad celular; parámetros determinables mediante citometría de flujo.

  16. Cytometry 2001:44;188-94 Appl Environ Microbiol 1998:64;3900-9 Cytometry 2000:41;41-5 Estimación de bio volumen bacteriano Cytometry 1999:35;55-63 Antimicrob Agents Chemother 2000:44;827-834 Methods 2000:21;271-279 Cytometry 2001:43;223-226 Antimicrob Agents Chemother 2000:44;682-687 DY en Gram positivos y Gram negativos J Microbiol Methods 2000:42(1);1-2 Letters Appl Microbiol 2002:34;1-7 Cytometry 1997:29;298-305 Cytometry 1994:17;302-309 Ácidos nucleicos y viabilidad celular Cytometry 1994:17;302-9 Antimicrob Agents Chemother 2000:44;676-681 Antimicrob Agents Chemother 1998:42;1195-1199 FEMS Microbiol Rev 2000:24;429-448 Antimicrob Agents Chemother 2000:44;682-687 Efecto de antimicrobianos sobre bacterias. Análisis monoparamétrico de poblaciones celulares Cytometry Part A 2003:53A;97-102 Cytometry 1998:32;241-254 Cytometry 2001:43;55-68

  17. Cepas bacterianas • Escherichia coli ATCC 25922 • Staphylococcus aureus ATCC 29213 • Helicobacter pylori ATCC 43504 Viabilidad celular Potencial de membrana Eflujo a BrEt • Escherichia coli K12 • Pseudomona aeruginosa • Acinetobacter spp. • Bacillus subtilis • Helicobacter pylori 636-C, 594-C, 612-C, 632-C633-A Estimación de patrones de tamaño bacteriano

  18. Cultivo líquido (18 hrs, 37°C) en caldo Müller Hinton filtrado (0.20 mm) Bacterias vivas Bacterias muertas

  19. Protocolo básico de trabajo Cultivo líquido (18 hrs, 37°C) Tubo 1 2 3 4 5 6 Células vivas (ml) 15 12 9 6 3 0 Células muertas (ml) 0 3 6 9 12 15

  20. Protocolo de evaluación de viabilidad • 15 ml células vivas y/o muertas • 1.0 ml de PBS • 10 ml PI (1 mg/ml) • Incubar 5 minutos a T° ambiente y en oscuridad • Adquirir en Citómetro de flujo • Analizar fluorescencia roja

  21. Protocolo de evaluación de DY • 15 ml células vivas y/o muertas • 1.0 ml de PBS (o PBS-EDTA) • 30 ml DiOC2(3)1 mM (30 mM Concentración final) • Incubar 4 minutos a T° ambiente y en oscuridad • Adquirir en Citómetro de flujo • Analizar fluorescencia roja y verde

  22. Metodología Citometría de Flujo • FACSCalibur, B.D. • Láser de Argón, 488 nm. Equipo • Software CellQuest v3.3 • Máximo de 1000 eventos/seg. • 20.000 eventos celulares Adquisición • Software CellQuest v.3.3 • Media de intensidad de fluorescencia • verde y roja. • Cálculo razón F. roja / F. verde • Software Flow Explorer Análisis Rev Méd Chile 1999:127;1385-1397 Antimicrob Agents Chemother 2000:44;827-834 Cytometry 1999:35;55-63 / 2001:43;223-226

  23. http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/software/flowex4_files/Install4.exehttp://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/software/flowex4_files/Install4.exe Email Flow explorer Tubo PM.001 (CELLQuest) 1PM.001 CELLQuest Cáculo de razón FL2/FL1 FACS Convert Nueva fila (1pm.001) Gráficos Email Mac

  24. Resultados • Estimación patrones de tamaño • Incorporación de PI en S. aureus y E. coli • DY en S. aureus y E. coli • Incorporación de PI y DY en H. pylori • Eflujo a bromuro de etidio en S. aureus y E. coli • Eflujo a bromuro de etidio en H. pylori

  25. Definición de gate de análisis

  26. M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 Markers (+/- channels) E. coli P. aeuriginosa Acinetobacter sp. B. subtilis Estimación de patrones de tamaño

  27. Estimación de patrones de tamaño

  28. Estimación de patrones de tamaño en cepas de H. pylori

  29. Resultados • Estimación patrones de tamaño • Incorporación de PI en S. aureus y E. coli • DY en S. aureus y E. coli • Incorporación de PI y DY en H. pylori • Eflujo a bromuro de etidio en S. aureus y E. coli • Eflujo a bromuro de etidio en H. pylori

  30. Incorporación de PI Células vivas Células vivas y muertas (1:1) 51.37% 0.98% Células muertas 99.03%

  31. E. coli: Incorporación de PI por células muertas por calor R = 0.997 S. aureus: Incorporación de PI por células muertas por calor R = 0.692 Agregados y destrucción celular

  32. E. coli: Incorporación de PI por células muertas (shock frío). Ensayo en triplicado. R = 0.978 S. aureus: Incorporación de PI por células muertas (shock frío). Ensayo en triplicado. R = 0.981

  33. Resultados • Estimación patrones de tamaño • Incorporación de PI en S. aureus y E. coli • DY en S. aureus y E. coli • Incorporación de PI y DY en H. pylori • Eflujo a bromuro de etidio en S. aureus y E. coli • Eflujo a bromuro de etidio en H. pylori

  34. Estimación de DY dep. dep. dep. pol. pol. pol. Células vivas y muertas (1:1) Células muertas Células vivas

  35. Estimación de DY dep. dep. Flow Explorer pol. pol. Razón FL2/FL1 Células vivas y muertas (1:1)

  36. S. aureus: Células polarizadas y depolarizadas. Razón flourescencia roja / verde (DioC2(3)). Ensayo por triplicado. R = - 0.982 (pol) R = 0.982 (dep) E. coli: Células polarizadas y depolarizadas. Razón flourescencia roja / verde (DioC2(3)). Ensayo por triplicado. R = - 0.993 (pol) R = 0.993 (dep)

  37. Resultados • Estimación patrones de tamaño • Incorporación de PI en S. aureus y E. coli • DY en S. aureus y E. coli • Incorporación de PI y DY en H. pylori • Eflujo a bromuro de etidio en S. aureus y E. coli • Eflujo a bromuro de etidio en H. pylori

  38. H. pylori: Incorporación de PI

  39. H. pylori: Incorporación de DioC2(3)

  40. Resultados • Estimación patrones de tamaño • Incorporación de PI en S. aureus y E. coli • DY en S. aureus y E. coli • Incorporación de PI y DY en H. pylori • Eflujo a bromuro de etidio en S. aureus y E. coli • Eflujo a bromuro de etidio en H. pylori

  41. Eflujo a Bromuro de Etidio Ingreso por difusión pasiva Intercalante Monocatiónico Sistema de eflujo del tipo MFS (Major facilitator superfamiliy): • Dependiente de la fuerza protón motriz • Sustratos: • Fluoroquinolonas hidrofílicas • Compuestos orgánicos monocatiónicos (Acriflavina, BrEt, Bromuro de tetrafenilfosfonio) Fluorescencia Balance entre influjo y eflujo Exclusión Bajo influjo y/o presencia de eflujo

  42. Protocolo de evaluación de eflujo a Bromuro de Etidio • 15 ml células vivas y/o muertas • 1.0 ml de PBS • 20ml BrEt (20 mg/ml concentración final) • Incubar 5 minutos a T° ambiente y en oscuridad • Adquirir en Citómetro de flujo • Analizar fluorescencia roja. Cytometry 1994:17;302-309

  43. 97.95 % 1.29 % Eflujo a Bromuro de Etidio Células vivas Células muertas

  44. Incorporación de PI y eflujo a bromuro de etidio E. coli S. auerus R=0.999 R=0.999 R=0.999 R=0.998

  45. Resultados • Estimación patrones de tamaño • Incorporación de PI en S. aureus y E. coli • DY en S. aureus y E. coli • Incorporación de PI y DY en H. pylori • Eflujo a bromuro de etidio en S. aureus y E. coli • Eflujo a bromuro de etidio en H. pylori

  46. H. pylori: Eflujo a bromuro de etidio

  47. H. pylori: Incorporación de PI H. pylori: Eflujo a BrEt H. pylori: Incorporación de DioC2(3)

  48. Discusión • Desarrollo de método de estimación de patrones de tamaño • Incorporación de PI en E.coli y S.aureus • Ensayo de DY en E.coli y S.aureus • Uso de Razón de Fluorescencia Roja/verde • H. pylori: PI, BrEt y DY

  49. Discusión Desarrollo de método de estimación de patrones de tamaño • Medición de FSC usada ampliamente • Indice de refracción • Aplicaciones • Limitaciones: • Células en suspensión • Tamaño no cuantificable • Mezcla de poblaciones celulares • Ventajas: • Método sencillo y económico • Uso de parámetros intrínsecos a la células

  50. Discusión Incorporación de PI en E.coli y S.aureus • Concepto • Controles • Linealidad • Definición de viabilidad celular • Ventajas: • Método sencillo y económico • Combinación con parámetros intrínsecos a la células

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