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Ana Serrano Esteban

The riboflavin kinase and adenylyltransferase catalytic sites of the bifunctional FAD synthetase from Corynebacterium ammoniagenes. Ana Serrano Esteban. INTRODUCCIÓN. H 2 N. COOH. H 2 N. FMNAT. RFK. FMNAT. Riboflavina kinasa (RFK). Adenililtransferasa(FMNAT). Mg 2+. Mg 2+.

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Presentation Transcript

  1. The riboflavin kinase and adenylyltransferase catalytic sites of the bifunctional FAD synthetase from Corynebacterium ammoniagenes Ana Serrano Esteban

  2. INTRODUCCIÓN H2N COOH H2N FMNAT RFK FMNAT Riboflavina kinasa (RFK) Adenililtransferasa(FMNAT) Mg2+ Mg2+ ATP ADP ATP PPi Riboflavina (vitaminaB2) FAD FMN Procariotas FAD SINTETASA (FADS) Eucariotas (levaduras y mamÍferos) COOH FMNAT COOH H2N RFK

  3. INTRODUCCIÓN Producción de energía Remodelado de cromatina Reducción Reparación del DNA Oxidación Apoptosis Oxigenación Plegamiento de proteínas Emisión de luz Detoxicación Reacciones no redox Desarrollo neuronal Biosíntesis Biodegradación IMPORTANCIA DE LA SÍNTESIS DE FLAVINAS FADS bifuncionales son esenciales para los microorganismos Potenciales dianas terapéuticas

  4. RESULTADOS: MODELO ESTRUCTURAL DE LA FADS DE Corynebacterium ammoniagenes DOMINIO N –TERMINAL (Módulo FMNAT) N terminal (1-186) Mg2+ Mg2+ ATP PPi ATP ADP FAD FMN • No presenta homología estructural ni secuencial con las FMNATsmonofuncionales. • Pertenece a la familia de las NTs. Riboflavina (vitaminaB2) FMN DOMINIO C –TERMINAL (Módulo RFK) C terminal (186-338) • Comparte homología estructural y secuencial con las RFKs monofuncionales.

  5. RESULTADOS: MODELO ESTRUCTURAL DE LA FADS DE Corynebacterium ammoniagenes INTERACCIÓN DEL MÓDULO RFK CON RF Y ADP E295 R292 D310 F270 K296 T208 N210 F297 K202 RF ADP T208 T208 D277 E268 E268 E268 Y279 N210 N210 V193 1 sitio de unión a flavina 1 sitio de unión a ATP Frago et al. (2008) BMC Microbiol8:160

  6. RESULTADOS: MÓDULO RFK Módulo RFK Módulo RFK Módulo RFK Módulo FMNAT Módulo FMNAT Módulo FMNAT Módulo RFK Módulo FMNAT Módulo RFK Módulo FMNAT INTERACCIÓN CON FLAVINAS (ESPECTROSCOPIA DIFERENCIAL) WT T208A T208D N210A N210D E268A E268D 0.006 0.012 FADS:RF FADS:FMN FADS:FAD [FADS] 0.004 0.008 0.004 0.002 Absorbance / 0.000 0.000 -0.004 -0.002 -0.008 350 400 450 500 550 350 400 450 500 550 0.006 Wavelength (nm) Wavelength (nm) 0.004 0.012 [FADS] 0.004 0.008 0.002 0.002 0.004 Absorbance / 0.000 0.000 0.000 -0.004 -0.002 FADS-ADP:RF FADS-ADP:FMN -0.008 -0.002 ADP RF ADP FMN 350 400 450 500 550 350 400 450 500 550 350 400 450 500 550 FMN FAD RF RF Wavelength (nm) Wavelength (nm) Wavelength (nm) Frago et al. (2009) J BiolChem284:6610 ADP RF ADP FMN

  7. RESULTADOS: MÓDULO RFK Módulo RFK Módulo RFK Módulo RFK Módulo RFK Módulo FMNAT Módulo FMNAT Módulo FMNAT Módulo FMNAT INTERACCIÓN CON FLAVINAS (ITC) FADS:RF ΔG ΔH -TΔS 40 30 N=2 N=1 N=2 N=2 N=2 N=2 N=1 20 Kcal/mol 10 0 -10 -20 -30 Frago et al. (2009) J BiolChem284:6610 -40 Frago et al. (2009) J BiolChem284:6610 WT T208A T208D N210A N210D E268A E268D -50 El residuo T208 está implicado en la interacción de la RF en el módulo RFK. FADS:FAD FADS:FMN 40 40 N=1 N=1 N<1 N=1 N=1 N<1 N=1 30 30 N=1 N=1 N<1 N=1 N=1 N<1 N=1 RF FAD RF FMN 20 20 Kcal/mol Kcal/mol 10 10 0 0 -10 -10 -20 -20 -30 -30 -40 -40 WT T208A T208D N210A N210D E268A E268D WT T208A T208D N210A N210D E268A E268D -50 -50 Los residuos N210 y E268 parecen contribuir a la interacción de las flavinas en el otro módulo. RF

  8. RESULTADOS: MÓDULO RFK Módulo RFK Módulo RFK Módulo RFK Módulo RFK Módulo FMNAT Módulo FMNAT Módulo FMNAT Módulo FMNAT INTERACCIÓN CON ATP (ITC) 40 ΔG ΔH -TΔS N=2 N=1 N<2 N=2 N=2 N<2 N=1 30 20 10 Kcal/mol 0 -10 -20 -30 -40 WT T208A T208D N210A N210D E268A E268D -50 El residuo T208 está implicado en la estabilización del nucleótido en el módulo RFK. ATP ATP ATP 10 mM Mg2+ 0 mM Mg2+ 0 mM Mg2+ 10 mM Mg2+ Frago et al. (2009) J BiolChem284:6610 En ausencia de Mg2+ el ATP se une preferiblemente al módulo FMNAT. ATP ATP Frago et al. (2009) J BiolChem284:6610

  9. RESULTADOS: MÓDULO RFK Módulo RFK Módulo RFK Módulo FMNAT Módulo FMNAT INTERACCIÓN CON FMN EN PRESENCIA DE ADP (ITC) 10 N=2 N=1 N=1 N=1 N=2 N=2 N=2 5 Site 1 Site 1 Site 2 Site 2 Site 1 Site 2 Kcal/mol 0 -5 -10 WT T208D N210A N210D T208A E268A E268D -15 Los residuos T208 y N210 parecen claves para alojar las flavinas en el módulo RFK. ADP FMN FMN ADP FMN Frago et al. (2009) J BiolChem284:6610

  10. RESULTADOS: MÓDULO RFK ACTIVIDAD RFK Mg2+ Mg2+ ATP ADP ATP PPi Riboflavina (vitaminaB2) FAD FMN • WT •  N210D • E268D

  11. Herguedas et al. (2010) J Mol Biol400:218 T208 V271 La interacción con el ATP debe implicar un cambio conformacional. F270 P207 Mg 2+ N210 E268 CaFADS Bauer et al. (2010) J Mol Biol326:1463 P44 P44 H98 H98 T45 Mg 2+ T45 Mg 2+ E96 N47 N47 E96 RFK Saccharoymices pombe (SpRFK) SpRFK:FMN:ADP

  12. RESULTADOS: MODELO ESTRUCTURAL DE LA FADS DE Corynebacterium ammoniagenes INTERACCIÓN DEL MÓDULO FMNAT CON ATP Y FMN Y106 A124 A124 L34 L34 31 28 ATP ATP F128 N125 N125 P56 R161 R161 R161 F24 F24 L98 H31 H31 H31 I62 I62 FMN P58 H57 S164 S164 S164 H28 H28 H28 V59 F54 D25 D25 T165 T165 T165 F62 R168 R168 161 164 165 1 sitio de unión a flavina 1 sitio de unión a ATP Frago et al. (2008) BMC Microbiol8:160

  13. RESULTADOS: MÓDULO FMNAT Módulo RFK Módulo FMNAT INTERACCIÓN CON FLAVINAS (ESPECTROSCOPIA DIFERENCIAL) FADS:RF WT H28A H28D R161A R161D S164A S164D T165A T165D Frago et al. (2009) J BiolChem284:6610 FADS:FAD FADS:FMN 0.008 0.008 0.004 [FADS] 0.004 0.004 0.000 Absorbance / 0.000 0.000 -0.004 -0.004 -0.004 350 400 450 500 550 350 400 450 500 550 350 400 450 500 550 Flavinas Wavelength (nm) Wavelength (nm) Wavelength (nm)

  14. RESULTADOS: MÓDULO FMNAT Módulo RFK Módulo FMNAT ΔG ΔH -TΔS FADS:FMN INTERACCIÓN CON FLAVINAS (ITC) FADS:FAD 60 60 N=1 40 40 N=1 N=1 N=1 N=1 N=1 N<<1 N=1 N=1 N<1 N<1 N=1 N=1 N=1 N=1 N=1 N=1 N<<1 N=1 N<1 N=1 N<1 20 20 Kcal/mol Kcal/mol El cambio entálpico tan grande indica una organización diferente en la interacción entre estos mutantes y la flavina. 0 0 -20 -20 Flavinas -40 -40 WT H28A R161A T165D T165A H28D H31A H31D R161D S164A S164D -60 -60 Frago et al. (2009) J BiolChem284:6610 H28D H31A H31D R161D S164A S164D WT H28A R161A T165A T165D

  15. RESULTADOS: MÓDULO FMNAT Módulo RFK Módulo FMNAT INTERACCIÓN CON ATP (ITC) ΔG ΔH -TΔS FADS:ATP 60 40 N=2 N=2 N=2 N=2 N=2 N=2 N=2 N=2 N<2 N=2 N=2 20 Kcal/mol 0 El sitio de unión al ATP en el módulo FMNAT queda alterado por la presencia de las mutaciones. ATP -20 ATP -40 Frago et al. (2009) J BiolChem284:6610 H28D H31A H31D T165A T165D R161D S164A S164D R161A WT H28A -60

  16. RESULTADOS: MÓDULO FMNAT ACTIVIDAD FMNAT Mg2+ ATP PPi FAD FMN Los residuos de His son críticos para la actividad FMNAT. • WT • R161A • R161D • S164A • T165A •  T165D

  17. Herguedas et al. (2010)J Mol Biol400:218 N125 R161 PPi H31 H28 S164 T165 W181 R168 ATP bindingcavity Isoalloxazinebindingcavity Isoalloxazinebindingcavity ATP bindingcavity

  18. CONCLUSIONES DOMINIO N –TERMINAL (Módulo FMNAT) DOMINIO C –TERMINAL (Módulo RFK) E268 E268 N210 T208 N210 N210 ADP ATP H28 H31 T208 T208 RF Mg2+ T208 Mg2+ PPi FMN FMN ATP Mg2+ FAD

  19. AGRADECIMIENTOS Milagros Medina Trullenque Adrián Velázquez-Campoy

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