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第六章 微生物的新陈代谢

第六章 微生物的新陈代谢. 代谢. 代谢 (metabolism) 是细胞内发生的各种化学反应的总称，它主要由分解代谢 (catabolism) 和合成代谢 (anabolism) 两个过程组成。 分解代谢：将大分子物质降解成小分子物质的过程。 合成代谢是：将简单的小分子物质合成复杂大分子的过程。. 分解代谢的作用. 提供前体化合物 提供细胞代谢活动所需的能量 生长：细胞结构物质合成 产物合成 维持：物质运输、运动、亚细胞结构形成、大分子周转等 提供还原力 NADH NADPH. 合成代谢. 由前体化合物合成大分子单体 由前体化合物合成产物

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第六章 微生物的新陈代谢

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Presentation Transcript

  1. 第六章 微生物的新陈代谢

  2. 代谢 • 代谢(metabolism)是细胞内发生的各种化学反应的总称，它主要由分解代谢(catabolism)和合成代谢(anabolism)两个过程组成。 • 分解代谢：将大分子物质降解成小分子物质的过程。 • 合成代谢是：将简单的小分子物质合成复杂大分子的过程。

  3. 分解代谢的作用 • 提供前体化合物 • 提供细胞代谢活动所需的能量 • 生长：细胞结构物质合成 • 产物合成 • 维持：物质运输、运动、亚细胞结构形成、大分子周转等 • 提供还原力 • NADH • NADPH

  4. 合成代谢 • 由前体化合物合成大分子单体 • 由前体化合物合成产物 • 由单体形成大分子化合物 • 蛋白 • 核酸 • 多糖 • 脂肪

  5. 分解代谢的三个阶段

  6. 分解代谢的三个阶段 • 第一阶段是将蛋白质、多糖及脂类等大分子营养物质降解成为氨基酸、单糖及脂肪酸等小分子物质； • 第二阶段是将第一阶段产物进一步降解成更为简单的乙酰辅酶A、丙酮酸以及能进入三羧酸循环的某些中间产物，在这个阶段会产生一些ATP、NADH及FADH2； • 第三阶段是通过三羧酸循环将第二阶段产物完全降解生成CO2，并产生ATP、NADH及FADH2。 　　第二和第三阶段产生的ATP、NADH及FADH2通过电子传递链被氧化，可产生大量的ATP。

  7. 能量与代谢的关系

  8. 还原态无机物 有机物 日光 通用能源ATP 能量代谢的中心任务

  9. 第一节 化能异氧微生物的生物氧化和产能 形式：与氧结合，脱氢，失去电子 过程：脱氢（电子），递氢，受氢 功能：产能(ATP)，产还原力([H])，产小 分子中间代谢物 类型：发酵，有氧呼吸，无氧呼吸

  10. 底物脱氢的4条途径 • EMP途径 • HMP途径 • ED途径 • TCA循环

  11. 糖酵解途径Embden-Meyerhof-Parnas pathway

  12. 功能 • 提供ATP • 提供还原力(NADH2) • 提供前体化合物 • 6-磷酸葡萄糖 • 磷酸三碳糖 • 磷酸烯醇式丙酮酸 • 丙酮酸 总反应： Glucose+2Pi+2ADP+2NAD+ 2Pyruvate+2ATP+2NADH+2H++2H2O

  13. HMP途径 • 即单磷酸己糖途径(Hexose Monophosphate Pathway)，也称戊糖磷酸途径(Pentose Phosphate Pathway)。 • 分为氧化阶段和非氧化阶段 • 功能： • 提供还原力(NADPH) • 提供前体化合物 • 核糖磷酸(包括5-磷酸核糖-1-焦磷酸, PRPP) • 磷酸赤藓糖

  14. HMP途径 Glucose 6-phosphate + 2 NADP+ + H2O → ribulose 5-phosphate + 2 NADPH + 2 H+ + CO2

  15. 磷酸戊糖途径提供NADPH的方式

  16. ED途径 Entner-Doudoroff pathway Glucose + ADP +Pi +NAD + NADP  2Pyruvate + ATP + NADH2 + NADPH2

  17. TCA循环

  18. 功能 • 提供还原力：3 NADH2，1 FADH2 • 提供能量：形成1 GTP • 提供前体化合物： • a-酮戊二酸 • 琥珀酸 • 草酰乙酸 AcCoA+3NAD+FAD+GDP+Pi+2H2O 2CO2+3NADH2+FADH2+GTP+CoA

  19. 2. 烃的利用 • 能分解烃类的微生物 • 细菌：假单胞菌 分枝杆菌 棒状杆菌 • 放线菌：链霉菌 诺卡氏菌 • 酵母菌：假丝酵母 • 应用 • 奈被假单胞菌利用生成水杨酸 • 丙烯腈生成丙烯酰胺 • 石油脱蜡 • 长链二元酸 • 二次采油 • 石油污染处理

  20. 3. 呼吸 微生物在降解底物的过程中，将释放出的电子交给NAD(P)+、FAD或FMN等电子载体，再经电子传递系统传给外源电子受体，从而生成水或其他还原型产物并释放出能量的过程。 • 有氧呼吸 • 无氧呼吸

  21. 1) 有氧呼吸 底物脱下的氢经过完整的呼吸链(电子传递链，Electron Transfer Chain－ETC)传递,最终被外源分子氧接受，产生水并释放出ATP形式的能量

  22. 电子传递系统

  23. ATP的生成

  24. 2) 无氧呼吸 • 呼吸链末端的电子受体不是氧 • 可作为电子受体的物质： • NO3－ • NO2－ • SO42－ • CO2 • 能量生成效率低于氧

  25. 第二节 化能自养微生物的生物氧化 一些微生物可以从氧化无机物获得能量，同化合成细胞物质，这类细菌称为化能自养微生物。它们在无机能源氧化过程中通过氧化磷酸化产生ATP。 能源： • H2 H2+½O2H2O G0’=-237.2kJ/mol • NH3 • S • Fe

  26. 氨的氧化 • NH4++1½O2NO2-+2H++H2O G0’=-270.7kJ/mol • NO2-+½O2NO3- G0’=-77.4kJ/mol • NH3和NO2-是可以用作能源的最普通的无机氮化合物，能被硝化细菌所氧化，硝化细菌可分为两个亚群：亚硝化细菌和硝化细菌。 • 氨氧化为硝酸的过程可分为两个阶段，先由亚硝化细菌将氨氧化为亚硝酸，再由硝化细菌将亚硝酸氧化为硝酸。由氨氧化为硝酸是通过这两类细菌依次进行的。

  27. 硝化细菌都是一些专性好氧的革兰氏阳性细菌，以分子氧为最终电子受体，且大多数是专性无机营养型。它们的细胞都具有复杂的膜内褶结构，这有利于增加细胞的代谢能力。硝化细菌无芽孢，多数为二分裂殖，生长缓慢，平均代时在10h以上，分布非常广泛。硝化细菌都是一些专性好氧的革兰氏阳性细菌，以分子氧为最终电子受体，且大多数是专性无机营养型。它们的细胞都具有复杂的膜内褶结构，这有利于增加细胞的代谢能力。硝化细菌无芽孢，多数为二分裂殖，生长缓慢，平均代时在10h以上，分布非常广泛。

  28. 硫的氧化 • S2-+2O2SO42- G0’=-794.5kJ/mol • S0+1½O2+H2OSO42-+2H+ G0’=-584.9kJ/mol • 硫杆菌能够利用一种或多种还原态或部分还原态的硫化合物(包括硫化物、元素硫、硫代硫酸盐、多硫酸盐和亚硫酸盐)作能源。 • H2S首先被氧化成元素硫，随之被硫氧化酶和细胞色素系统氧化成亚硫酸盐，放出的电子在传递过程中可以偶联产生四个ATP。 • 亚硫酸盐的氧化可分为两条途径，一是直接氧化成SO42-的途径，由亚硫酸盐-细胞色素c还原酶和末端细胞色素系统催化，产生一个ATP；二是经磷酸腺苷硫酸的氧化途径，每氧化一分子SO32-产生2.5个ATP。-

  29. 铁的氧化 • Fe2++¼O2+H+Fe3++½O2 G0’=-44.4kJ/mol • 从亚铁到高铁状态的铁的氧化，对于少数细菌来说也是一种产能反应，但从这种氧化中只有少量的能量可以被利用。 • 亚铁的氧化仅在嗜酸性的氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferrooxidans)中进行了较为详细的研究。在低pH环境中这种菌能利用亚铁氧化时放出的能量生长。 • 在该菌的呼吸链中发现了一种含铜蛋白质(rusticyanin)，它与几种细胞色素c和一种细胞色素a1氧化酶构成电子传递链。在电子传递到氧的过程中细胞质内有质子消耗，从而驱动ATP的合成。

  30. 第四节 生物合成 • 合成结构物质 • 核酸 • 蛋白 • 多糖 • 脂肪 • 合成产物 • 需要前体化合物、能量、还原力

  31. 1. 光合作用 • 光反应：叶绿素释放电子，产生ATP和NADPH2 • 暗反应：通过卡尔文循环(Carvin cycle)将CO2转变为有机化合物 • 固定CO2 • 消耗大量ATP • 消耗大量还原力(NADPH2)

  32. ATP和NADPH2由光反应产生 • 首先固定CO2：CO2与核酮糖1,5-二磷酸(RuBP)经核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(Rubisco)作用形成2个3-磷酸甘油酸 • 大部分3-磷酸甘油酸用于生成RuBP，少部分用于合成葡萄糖 • 反应： 6 CO2 + 12 NADPH + 12 H+ + 18 ATP → C6H12O6 + 6 H2O + 12 NADP+ + 18 ADP + 18 Pi

  33. 2. 糖异生 • 不是简单的酵解途径的逆转

  34. 3. 固氮 • 生物固氮反应的6个要素 • ATP 的供应 • 还原力及其传递载体 • 固氮酶(nitrogenase) • 还原底物N2 • 镁离子 • 严格的厌氧环境

  35. 固氮酶 • 2个固氮铁氧还蛋白(还原酶) • 1个钼铁氧还蛋白(固氮酶) • 固氮消耗大量能量 N2+3H22NH3 H=-91.2kJ

  36. 固氮的生化机制 2H+ H2 铁氧化蛋白其他电子递体 e- e- e- 产能代谢 铁蛋白 钼铁蛋白 MgATP MgADP+Pi 6H++N2 2NH3 N2+8[H]+18~24ATP 2NH3+H2+ 18~24ATP + 18~24Pi

  37. 4. 细胞结构物质合成 • 氨基酸 • 核苷酸 • 多糖 • 脂肪

  38. 应用

  39. 0.5 20 0.4 16 ) u/L) gh (g/ 0.3 12 5 (10 -1 D=0.352 h A Q 0.2 IFN 8 Q 0.294 0.1 4 0.148 0 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 0 1 2 3 4 5 -1 Acetate in Feed (g/L) Dilution Rate (h ) 1 发酵过程分析应用实例 • 大肠杆菌高密度培养 在葡萄糖为碳源的培养基中大肠杆菌会产生副产物乙酸，抑制生长和外源基因表达。发酵过程中维持葡萄糖限制的状态能有效避免乙酸的积累。 • 控制碳源流加避免溢流代谢物积累

  40. 碳源的流加 • 恒溶氧 • 恒pH

  41. (a) 恒溶氧流加 • 原理 随菌体浓度增加，耗氧速率(OUR)增加，在一定供氧条件下溶氧下降。碳源消耗引起耗氧速率降低和溶氧急速上升。限制葡萄糖流加可造成溶氧振荡，发酵液中浓度可维持在不能测出的低浓度，避免乙酸积累。

  42. Pichia pastoris表达血管生长抑制素 • Pichia pastoris具有很强的醇氧化酶(AOX1)启动子 • 外源基因插入并保持完整的AOX1显示Mut＋表型，外源基因插入破坏AOX1显示MutS表型。 • 发酵的生长阶段以甘油为碳源，表达阶段以甲醇为碳源。 • 表达血管生长抑制素的P. pastoris为MutS，甲醇利用能力很差。

  43. 100 80 60 Dissolved oxygen (%) 40 20 0 46 56 66 76 86 96 Time (h) Dissolved oxygen profile during the induction phase with automatic feeding of methanol

  44. Dissolved oxygen, pH, temperature and agitation profilesin the fed-batch culture. Fermentation control software (Tophawks) was kindly provided by the National Center of Biochemical Engineering (Shanghai)

  45. (b) 恒pH流加 • 复合培养基中碳源消耗后，氨基酸异化代谢引起pH上升，加入碳源pH下降。 • 大肠杆菌表达hEGF由phoA启动子控制。

  46. DO变化与pH变化的关联

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