天津市药品检验所 黄志东

1. 微乳液相色谱法在药物分析中的应用 天津市药品检验所 黄志东

2. 主要讨论的内容: • 1.微乳液的定义、结构与特征及其制法 • 2.微乳液相色谱的特点、分离机制和影响因素 • 3.微乳液相色谱的应用 • 4.展望

3. 1.微乳液的定义、结构与特征及其制法 1.1 定义 由表面活性剂、助表面活性剂(通常为醇类)、油(通常为 碳氢化合物)和水(或盐水)在合适的比例下自发形成的热力学 稳定、各向同性、 低黏度、外观透明或半透明、粒径在10～ 100nm的分散体系。

4. 1.微乳液的定义、结构与特征及其制法 1.2 结构与特征 结构： 根据连续相和分散相的成分，均一单分散的微乳液又可分 为水包油(O/W)即正相微乳液(也就是正相微乳液与过量的水相 共存)和油包水(W/O)即反相微乳液(也即反相微乳液与过量油共 存)。 微乳液具有及其多变的微观结构，而且随着客观条件的改 变，不同类型的微乳液之间可以相互转变。

5. 1.微乳液的定义、结构与特征及其制法 1.2 结构与特征 特征： 微乳液的粒径介于胶束和宏观乳液之间,乳液一般大于100 nm，胶束则小于10nm；用电子显微镜观察微乳液时，发现颗粒 越细,分散度越窄,而一般的乳液的粒径分布较宽，既颗粒大小 非常悬殊；微乳液一般为澄清、透明或者半透明的分散体系， 有的有乳光，而一般的乳液通常为不透明的乳白色；微乳液稳 定性好，长时间放置也不会分层和破乳,若将其放在100个重力 加速度的超速离心机中旋转几分钟也不会分层，而乳液则会分 层；微乳液具有超低界面张力的性质。

6. 1.微乳液的定义、结构与特征及其制法 1.3 制法 首先要通过三元相图找出微乳区域，从而确定各成分的用 量范围。确定各组分比例后，再行制备。 微乳液的制法有两种:一种是把烃、水、乳化剂混合均匀， 然后向该乳液中滴加醇，在某一时刻体系会突然间变得透明， 这样获得了微乳液，即Schulman法；另一种是把烃、醇、乳化 剂混合为乳液体系，向该乳液中加入水，体系也会在瞬间变成 透明，即Shah法。还有文献报道另一种方法是不加醇，而是加 入某种强极性单体，如丙烯酰胺、三甲基氯化铵等，在选择适 当乳化剂的情况下，也能得到微乳液。文献报道将混合后的微 乳体系超声30 min，有助于促进各成分的分散，制得的微乳更 加稳定。实验发现，除超声外，有的微乳体系需要静置足够的 时间才能形成（与温度有关）。为了防止油相的挥发，混合应 该在密闭容器中进行。

7. 2.微乳液相色谱的特点、分离机制和影响因素 2.1 特点 微乳液相色谱通常分为O/W(正相微乳液相色谱)和W/O (反 相微乳液相色谱)两种模式。 以微乳作为流动相的HPLC 的特点是：微乳能对疏水性组分 增溶,有利于复杂样品(溶解度、酸碱性和极性差别很大的药物) 的分离分析，应用范围宽； 用常用流动相通常需要进行梯度洗 脱的样品，用微乳流动相等梯度洗脱即可完成分析， 降低了分 析成本，缩短了分析时间 ；以微乳为流动相，可控操作参数较 多，容易改善溶质的保留行为，提高了分离度。 此外，微乳的 光学透明性可以使用紫外末端吸收波长(最低可达190nm)分析无 生色团的样品。 微乳流动相对温度变化不敏感，色谱峰重现性 好。

8. 2.微乳液相色谱的特点、分离机制和影响因素 2.2 分离机制 使用微乳做流动相时,表面活性剂分子单体可以吸附在固定 相表面。溶质在修饰后的固定相、水相和微乳液滴三相间转移, 类似于胶束液相色谱(MLC)中的三相平衡。但由于微乳中的助表 面活性剂和油相分子可以置换吸附在固定相表面的表面活性剂, 所以，两种色谱的三相平衡基础是不同的。 以胶束为流动相的HPLC，表面活性剂在固定相表面上形成 吸附层，因此，传质速率低，柱效较低。微乳HPLC的分离机制 与胶束色谱相同，但由于加入的助表面活性剂从固定相表面上 释放表面活性剂，加速传质，克服了胶束流动相的缺点，溶质 或从水相或从固定相分配进入含油液滴，更有利于提高色谱的 分离能力。

9. 2.微乳液相色谱的特点、分离机制和影响因素 2.3 影响因素 2.3.1 对于O/W 型微乳液相色谱 2.3.1.1 表面活性剂的浓度和类型 在微乳形成的浓度范围内, 随着表面活性剂浓度的增加, 微 乳液滴的体积增加。但吸附有表面活性剂单体的固定相性质不 受其浓度影响，因此不影响溶质与固定相的相互作用，只影响 那些与微乳液滴有相互作用的溶质,即亲脂化合物的保留降低, 而不分配进入油滴的亲水性成分不受影响。改变表面活性剂类 型，会使固定相吸附层的性质和微乳液滴的大小及表面电荷均 发生变化，从而改变溶质和微乳及溶质和固定相之间的分配， 影响分离的选择性；离子型表面活性剂的电荷性质还影响溶质 与液滴、溶质与固定相吸附层之间的静电相互作用,而且带正、 负电荷的表面活性剂与固定相的结合作用有可能不同，对离子 型化合物的分离影响较大。与本清源SDS相比,当使用非离子型 的吐温类做表面活性剂时，含羧基类化合物的保留增加。使用 DTAB等阳离子表面活性剂时中性化合物峰型变差，洗脱顺序也 与用SDS时不同。

10. 2.微乳液相色谱的特点、分离机制和影响因素 2.3 影响因素 2.3.1 对于O/W 型微乳液相色谱 2.3.1.2 助表面活性剂的浓度和类型 助表面活性剂一般为短链醇，常用的有丙醇、丁醇、戊醇 和丙二醇等。助表面活性剂含量增加对组分保留的影响不及表 面活性剂，但其类型不同对分离的选择性影响较大。丁醇可以 在微乳油滴与外层水相的界面上进行分布，使微乳体积增加， 但可能存在容量的限制,低于最大量时,对组分保留影响不大； 超过此限量时，由于丁醇不能再与液滴结合而进入水相，增加 了流动相中有机相的比例，使疏水性物质的洗脱加快。在3.3% SDS、0.8%辛烷和丁醇组成的微乳里,丁醇的最大容量可能是9%; 而在2.85%SDS胶束溶液中，丁醇的最佳含量是5%(w/w)。

11. 2.微乳液相色谱的特点、分离机制和影响因素 2.3 影响因素 2.3.1 对于O/W 型微乳液相色谱 2.3.1.3 油相的浓度和类型 油相对中性疏水物质的影响较大。一方面，油相的加入可 以增加流动相中有机相的比例，使保留时间缩短；另一方面， 油相分子也可以部分分配到固定相上,使固定相的极性也变小, 因而使得化合物保留和选择性的变化更复杂。由于油相在水包 油型微乳中所占比例较小(＜1%)，油相在色谱分离中的作用还 有待深入考察。无疑，油相的加入对增加疏水性化合物的溶解 性是有显著作用的，因而对强疏水性的化合物的洗脱有利。

12. 2.微乳液相色谱的特点、分离机制和影响因素 2.3 影响因素 2.3.1 对于O/W 型微乳液相色谱 2.3.1.4 水相pH值和离子强度 对于弱酸弱碱性化合物，pH 值影响其解离型和游离型的平衡关系，因 而影响其在固定相和流动相的分配。 对酸类来说，pH 降低时游离型比例增 大，保留时间延长，这与常规液相结果是类似的，而中性化合物如萘则不受 pH变化的影响。 水相中离子强度大有利于较高水含量的微乳的形成。有人用SDS-丁醇- 辛烷-0.01 mol/L 硼酸钠微乳体系做流动相, 在梯度洗脱方式下分离一系列 碱性药物。在水含量较高的起点，产生很强的紫外吸收信号, 表明两相混合 时引起了微乳结构的破坏。用0.5 mol/L NaCl溶液代替水后,噪音信号降低, 表明微乳保持稳定。

13. 2.微乳液相色谱的特点、分离机制和影响因素 2.3 影响因素 2.3.1 对于O/W 型微乳液相色谱 2.3.1.5 固定相的影响 固定相的填料类型、孔径大小、柱子长短都会对分离产生影响。据报 道，由于胶束的直径与普通液相填料的孔径相当，胶束溶液做流动相时,在 填料的孔隙内部停留的溶质不易洗脱;使用大孔径的色谱柱填料可增加胶束 溶液的洗脱能力,使用短柱或渗透性更好的整体柱能增加洗脱速度而不影响 柱效。微乳液滴的直径比胶束大10倍左右(这与油相的加入量有关),固定相 的孔径对分离效率的影响可能更为明显。Altria等 联合应用微乳流动相和 整体柱对药物进行分离，表明整体柱可以减少柱后压,增加流速以缩短分离 时间。但整体柱应用于MELC，其在柱效方面的变化尚需进行深入研究。

14. 2.微乳液相色谱的特点、分离机制和影响因素 2.3 影响因素 2.3.1 对于O/W 型微乳液相色谱 2.3.1.6 其它因素 MELC 对于样品溶剂和柱温变化不太敏感，但柱温升高一般可加快溶质 的质量转移，提高分离效率。加入离子对试剂或环糊精等,可改变分离的选 择性。采用梯度洗脱方式，能使被测物涵盖更大的极性和溶解性范围,分析 速度也加快,适于复杂样品的分离。而且因为增加微乳液滴的浓度不会改变 固定相的结构和组成，使用微乳做流动相进行梯度洗脱时,两次进样之间不 需要再平衡，比有机溶剂/水系统的梯度分离节省时间。 有报道研究了在辛伐他汀的杂质色谱分离过程中,微乳流动相的结构和 界面性质对其所产生的影响:色谱分离优化过程中使用具有最小粒径和薄膜 厚度,最低表面张力的微乳,结果发现溶质和固定相之间的疏水性相互作用、 微乳流动相的微观结构特性对分离辛伐他汀和杂质的色谱行为产生显著影 响。

15. 2.微乳液相色谱的特点、分离机制和影响因素 2.3 影响因素 2.3.2 W/O微乳液相色谱 尽管MELC的第一篇文献报道采用的是W/O型微乳做流动相,到目前为止， W/O MELC的研究很少，可能与其粘度大，柱压过高有关。Berthod等研究50 种不同组成比例的AOT-水-庚烷微乳体系对4-硝基苯甲酸和4-硝基苯酚的保 留行为的影响时，发现两者的保留因子与微乳的理化结构参数MW/AOT(水与 AOT的摩尔比)紧密相关。最近;Altria等以SDS-庚烷-戊醇-醋酸钠缓冲液组 成的W/O型微乳体系为对象，较为系统的研究了微乳的组成和柱温、流速等 操作参数对萘、4-羟基乙酰基苯酮、对乙酰氨基酚和烟酰胺分离的影响.结 果发现庚烷相对于己烷和十二烷，可在相对短的时间给出最好的分离;助表 面活性剂(醇类)碳链长度增加，保留时间和分离度都增加;表面活性剂种类 影响分离选择性,中性表面活性剂和离子型表面活性剂混合使用可降低前者 极性头部基团的排斥作用,产生更大的液滴,使水溶性溶质更容易进入水核， 保留时间降低；在形成稳定微乳的条件下,水含量变化对保留因子和分离度 影响不大，但水含量高时微乳体积大,粘度大，柱压增加；低流速和高柱温 可改善分离。

16. 3.微乳液相色谱的应用 3.1 复杂混合物的分离 由于微乳体系对亲脂性和亲水性化合物均有较强的溶解能 力，溶质与微乳液滴及固定相吸附层之间存在着疏水、氢键、 静电等多种作用力，MELC适用于复杂混合物的分离。有人用2% SDS-10%丁醇-1%辛醇-含0.3%三氟乙酸的0.02 mol/L磷酸溶液体 系，10 min内分离了9种化合物，包括4种碱性的抗高血压药物 （阿替洛尔、醋丁洛尔、纳多洛尔、噻吗洛尔）、4种酸性的非 甾体抗炎药物（呋塞米、布美他尼、布洛芬、奈普生）和1种中 性化合物萘。Marsh等使用3.3%SDS-6.6%丁醇-0.8%辛醇-0.05% 三氟乙酸微乳体系，用等度洗脱方式成功分离了4个中性（倍氯 米松、氟地松、氢氯噻嗪、芘）、3个碱性（地喹氯铵、阿替洛 尔、布比卡因）、2个酸性（头孢氨苄、亚叶酸钙）和 1个两性 化合物（灰黄霉素）。分析时间为14min。以上混合物均为标准 混合物，实际样品的分析尚未见报道。

17. 3.微乳液相色谱的应用 3.2 制剂分析 稳定性考察是制剂分析中的一个重要内容，所建方法要能够将合成的或 降解的杂质从主成分峰和辅料峰中分开。MELC在稳定性研究中的潜力已被多 种化合物的测定所证实。Marsh等使用质量分数在0.0211～0.0775g/L内的5 种样品溶液进行线性试验，线性良好。两种 500 mg 萘普生片的分析结果是 527.89和502.84mg。此外，他们用梯度方法分离了过期变质的雷尼替丁、强 烈破坏的甲氧萘丙酸以及沙美特罗和氟地松混合样品, 所有杂质与主药峰和 辅料峰分离良好。ElSherbiny等用0.15 mol/L SDS- 10%丙醇- 1% 辛醇- 0.02%磷酸(0.3%三乙胺, pH 7.0)微乳分离了氟桂利嗪和它的4个降解产物。 Malenovic等采用全因素设计，得到优化的微乳体系2.2%SDS- 7%丁醇- 1%辛 醇-89.9%Na2HPO4(0.025 mol/L, pH 7.0),用其分离了辛伐他汀和它的６个 相关杂质，所用色谱柱为X Terra(4.6mm×50mm，3.5μm)。

18. 3.微乳液相色谱的应用 3.3 分析水不溶性化合物的能力 疏水性强的化合物由于在水中溶解度低,当采用反相HPLC分析时，会受 到许多限制。微乳流动相虽然含有高比例的水,但微乳液滴的疏水性环境能 够溶解不溶于水的组分。以SDS-正丁醇-辛醇为微乳流动相,1.5ml/min的流 速，采用Phenomenex Luna C18(4.6mm×100mm，3μm)柱,对数种疏水性化 合物进行分析。其中疏水性较强的蒽、萘、芘和硫酸氯喹可在13min洗脱。 对含有BDP、对羟基苯甲酸丁酯、FP、芘和羟萘沙美特罗等不溶性化合物的 混合物也成功地进行了分离，分析时间仅为10min。增加表面活性剂和助表 面活性剂的含量，使油的含量从0.8% 增加到2%，微乳流动相的疏水性则更 强，能够较快地洗脱水不溶性化合物。使用这种组成的微乳，BDP可在3min 内洗脱，而油的含量为0.8% 时，BDP在6.2min才能被洗脱。

19. 3.微乳液相色谱的应用 3.4 生物样品分析 尽量简化样品的前处理步骤一直是生物样品分析工作者们努力的方向之 一，而直接进样分析的方法无疑是最简单最受欢迎的。直接进样不但可以节 省大量分析时间和样品及溶剂的用量，也可减少实验误差，提高测定结果的 准确度。由于微乳可溶解蛋白，用微乳做流动相时可以实现直接进样分析生 物体液样品的目标。Jancic等采用1.0%二异丙基醚-2.0%SDS-6.0%丙醇-91% Na2HPO4(0.025 mol/L, pH 2.8)微乳体系和Backerbond ENV (150mm×4.6 mm, 5 μm)色谱柱，将血浆样品经简单稀释后，直接进样，分离测定了佛 西诺普利的代谢产物佛西诺普利拉。所建方法满足FDA生物样品分析方法确 证的要求，测定的血浆药物浓度范围为0.4 ～ 27 mg/L。EISherbiny等用 2%SDS-10%丁醇-1%辛醇-0.02 mol/L磷酸溶液（含0.3% 三乙胺) 微乳，将血 浆和尿中的布美他尼和醋丁洛尔简单稀释(1∶1)并离心后，直接进样，荧光 法检测，血浆和尿中的布美他尼和醋丁洛尔的检出限/定量限分别是0.02和 0.1 mg/L、1和5 mg/L。值得注意的是，这种直接进样方法虽然简单，但因 为没有样品浓缩过程，只有在样品浓度较高时才能采用。

20. 4.展望 微乳体系可看做是一种修饰后的胶束溶液，即亲脂性的油相溶解在胶束 里。同MLC(胶束液相色谱)一样，MELC 也具有许多优于普通色谱的特点，如 有机溶剂用量较少，低成本，低污染；对亲水性和亲脂性化合物都具有较强 的溶解能力，在一种色谱条件下能够同时分离酸性、碱性和中性化合物；梯 度洗脱不需要柱的再平衡过程；血浆样品可直接进样分析等。此外，与 MLC 相比，MELC中可调节的操作参数更多，分离机制更加复杂，可为复杂混合物 的分离提供多种选择方案；在O/W 微乳体系中，油相的加入使微乳的结构较 刚性的胶束松散，液滴尺寸增加，亲脂性物质更容易进入微乳内核，因而洗 脱更快；微乳中的助表面活性剂也可以置换吸附在固定相上的表面活性剂， 由表面活性剂的吸附所引起的胶束液相色谱的柱效降低可能在微乳体系下得 到改善。作为常规色谱的补充，它的优势在于对于复杂组分的分离分析，特 别是对于疏水性物质的增溶作用，使其在多组分分离分析中具有广阔的应用 前景。但对其分离机制的研究还只是初步的探讨，未能从分子作用机制的基 础上加以解释。因此，MELC在分离机制、微乳组成及其理化结构对分离的影 响、组分的定量保留与结构关系以及中药分离等方面都存在很大的研究空间. 此外，由于微乳的类生物膜结构，预计其在药物膜通透性和活性预测方面也 能发挥重要的作用。由于微乳只在特定的相图区域内形成，确定微乳的处方 组成是制备微乳流动相的难点，而大量表面活性剂造成的微乳液相色谱与质 谱检测器的不兼容性是MELC在检测方面的一个主要的局限。

21. 谢谢!