به نام خدا

1. به نام خدا

3. نحوه نمونه‌گيري‌درغربالگری نوزادان و چالش هاي آن دکتر پروين سجاديان کارشناس مسئول بيماريهای غير واگير اداره مديريت آزمايشگاهی بهداشتی آزمايشگاه مرجع سلامت

4. هدف:اجرای‌کلیه‌برنامه‌های‌غربالگری‌نوزادان‌برای‌بیماریهایCH,PKU,G6PD در سطح کشورو اهمیت اجرای استانداردهای آزمایشگاهی یکسان، درهمه آزمایشگاههایی‌فعال در این زمینه و یا برنامه های آتی آنها با توجه به ورود از فاز استقرار برنامه كشوري‌غربالگري هيپو تيروئيدی به فاز گسترش و كنترل‌كيفي و نيز ورود به فاز گسترش فنيل کتون يوريا درآزمايشگاههاي غربالگري نوزادان درنوزادان‌تحت‌درمان‌تاسه‌سالگي‌هر ماه بايد مقدار فنيل‌آلانين چك شود و ميزان شير و تغذيه آنها راكنترل‌كرد و نيز درمواردي كه مقادير فنيل‌آلانين بيش از cut off باشد پزشك بيمار را هر هفته تحت نظر دارد • اجراي طرح آموزش-نظارت در برنامه بيماري هاي تحت مراقبت غير واگير • برگزاري‌دودوره‌برنامه‌تضمين‌کيفيت‌درآزمايشگاههاي‌غربالگري‌نوزادان:تکثيروارسال‌جزوه‌اصول‌تضمين کيفيت در آزمايشگاههای غربالگری نوزادان، چالش های موجود در تکنيک های عملی نمونه گيری و انجام آزمايشات غربالگری نوزادان • قراردادن دستورالعمل غربالگری نوزادان فنيل کتون اوری،G6PD واسلايد های نمونه گيری‌نوزادان(جهت انجام آزمايشات غربالگری)، در سايت آزمايشگاه مرجع سلامتو تكثير فيلم نمونه گيري • تهيه چک ليست پايش و نظارت مراکز نمونه گيری نوزادان و قرار دادن آنها در سايت آزمايشگاه مرجع سلامت

5. Quality Assurance • Pre analytical Errors • Analytical Errors • Post analytical Errors • استقراربرنامه تضمين کيفيت مي بايست در قسمتهاي قبل از آزمايش، حين انجام آزمايش و پس از آزمايش درآزمايشگاهها صورت گيرد.

6. Preanalytic Postanalytic • Patient Assessment Results Report • Test Request Test interpretation • Specimen Collection Specimen Management • Specimen Transport • Specimen Receipt

7. دريافت نمونه های فيلتر پيپر(DBS) توسط آزمايشگاهها پذیرش (نرم افزار پذیرش و جوابدهی) انجام آزمایش جوابدهی(نرم افزار پذیرش و جوابدهی)

8. Sampling • A separate room • Specimen collection table • Lancet • Sterile gauze • Isopropanol 70% • Filter paper • Hot water bath • Stand rack • Computer & Printer • Refrigerator • سهولت دسترسي و كيفيت عملكرد مراكز نمونه گيري(تقريباً 3832)

9. Specimen collection • آموزش كارکنان بخش نمونه گيری وپيگيری آن در جهت اجرای صحيح و اصولی نمونه گيري، وجودپرسنل ثابت و جانشين ذيصلاح • روند‌‌‌نمونه گيري: نوزاد در فاصله 3 تا 5 روز بعد از تولد • استفاده از کاغذ فيلتر 903 مورد تائيد طرح‌عدم بکارگيري فيلترهاي ديگر • نگهداری صحيح نمونه و انتقال آن در اسرع وقت • پر کردن فرم نمونه گيري :. قبل از شروع نمونه گيري شماره هاي پرسشنامه و کارت خوني را تطبيق داده و از يکسان بودن آنها مطمئن شويد اطمينان از يکسان بودن شماره ها بسيار مهم است . • آماده كردن نوزاد:گرم کردن پاشنه پاپاشنه پا را با يک گاز يا حوله ولرم به مدت 3 دقيقه تا جريان خون در محل افزايش يابد ( حرارت 41-40 درجه سانتيگراد باعث افزايش جريان خون در موضع مي شود). • تميز کردن با الکل ايزو پروپانول • نمونه گيري از نوزاد: • لانست زدن • پاک کردن قطره اول خون • قرار دادن قطرات بعدی روی فيلتر

19. مراقبت از زخم • نکات مهم در نمونه گيري: • نوع وضخامت فيلتر پيپر • حجم خون و يا سايز لكه خوني ( تعيين كننده غلظت ) • کم بودن حجم نمونه گرفته شده برروي فيلتر کاغذی و بصورت پرنشدن دايره يا عدم اشباع فيلتر کاغذی يکي از رايجترين منابع ايجاد خطا در بخش قبل از تجزيه و با توجه به اينکه قطر پانچ در اندازه‌گيري فنيل آلانين 5 ميليمتر مي باشد، پرکردن دايره از خون بسيار مهم و ضروري است کوچک بودن لکه خون منجر به اخذ نتيجه کمتر از مقدار واقعي مي‌شود. • نحوه تلقيح خون بر روي فيلتر پيپر • همو ليز(نمونه اي با گلبولهاي ليز شده داراي مقادير بيشتري فنيل آلانين ازنمونه ليز نشده دارد) • كنترل رطوبت اطاق • بدون چروک و يا تاخوردگي کارت هاي نمونه گيري • پيگيری جهت نمونه گيری مجدد نمونه هایی با کيفيت نامناسب • ثبت زمان ارسال نمونه‌واستفاده از شماره گذاری متمایز در ارسال مجدد کارتهای خونی

20. ويژگي هاي نمونه مناسب • 1- شکل نمونه بايد بصورت دايره باشد. • 2- قطر لکه خون بيش از 5 ميلي متر باشد. • 3- لکه خون از دو طرف همسان ديده شود. • 4- دو لکه روي هم نباشد. • 5- در يک دايره بيش از يک لکه نباشد . • 6- کاغذ فيلتر نمونه گيري آغشته به مواد خارجي نباشد. • 7- لکه هاي خون بدون اثر انگشت باشند

21. Specimen Collection

22. Properly collected specimen

32. Folds and creases through the blood circles

34. Circles not filled

35. شرايط نگهداري و انتقال نمونه • بصورت افقي روي راک مخصوص تقريبا 3 ساعت وقت لازم است تا لکه هاي خون در حرارت اتاق (25-15 درجه سانتي گراد) کاملا خشک شود. • در زمان خشک شدن از قرار دادن کارت هاي خوني در جريان هواي آلوده به دود و گردوغبار جداً خودداري شود از گذاشتن کارت هاي خوني در معرض حرارت و تابش مستقيم نور خورشيد اکيدا پرهيز شود. • هر يک از نمونه هاي كاملاً خشك شده‌راجداگانه و به ضميمه فرم مشخصات نوزاد در پاکت مجزاويا كاغذ شيشه نما مابين كارتهاي خوني قرار دهيد. • احتياط کنيد که خون يک نمونه با خون نمونه ديگر در تماس نباشد. • جابجائي و حمل و نقل نمونه هاي خون به آزمايشگاه بدون آسيب ديدگي(فشار به فيلتر پيپر وارد نگردد) وانتقال نمونه ها در حدود 24 ساعت بعد از گرفتن نمونه انجام گيرد.ودر صورت تعطيلي آخر هفته آزمايشگاه نمونه ها بايد در يخچال نگهداري شودمواد شيميايي وانواع ديگر نمونه ها نبايد در ظرف حمل كارتهاي خوني بسته بندي شوند

37. کارت هاي حاوي لکه هاي خون در پاکت هاي پلاستيکي زيپ دار و حاوي سيليکاژن در حرارت (4 )درجه يخچال و ميزان رطوبت كمتر از 30درصد تا (2سال) و در فريزر منهاي 20 درجه سانتي گراد به مدت طولاني(بيش از 2 سال) پايدار مي مانددرمناطقي با رطوبت بيشتر از 30 درصد بعلت اثر نامساعد رطوبت بر ميزان جذب نوري حتماً در انتقال نمونه ها ونگهداري آنها بايد رطوبت محيط توسط كارتهاي معرف كنترل گردد.چراكه رطوبت بر روي پايداري نمونه نقش تعيين كننده دارد • نمونه هاي اخذ شده در اسرع وقت به آزمايشگاه غربالگري مرجع در مرکز استان ارسال شوند. • بازديد: • وجود معيارهاي قابل قبول يا رد نمونه بصورت مكتوب در آزمايشگاه ومراكز نمونه گيري • گزارش درصد ي ماهانه نمونه هاي نامناسب DBS • استفاده ازپرسنل ثابت • نگهداري سوابق بيماران • تهيه‌گزارش‌كامپيوتري‌پذيرش‌وجوابدهي(تدوينبرنامه چگونگي انتقال اطلاعات پذيرش‌وجوابدهي آزمايشگاههاي غربالگري نوزادان از محيط به ستاد بر اساس سيستم پرتال با همكاري مركز مديريت بيماريهاي غيرواگيروخاص ( دسترسي روزانه به اطلاعات) • اقدام به انجام آزمايش طي 48 ساعت پس از تحويل نمونه

40. کنترل کيفی فيلتر پيپر • نوع فيلتر پيپر 903داراي شماره ساخت، تاريخ انقضاء و Certificate • يکسان سازی فيلترپيپرها (تهيه آنها از يک منبع ) • جهت صحت فيلتر پيپر وبراي دسترسي به جذب يكنواختي درآن از روش ايزوتوپيك استفاده مي‌گردد. و نمونه خون تام انساني در اين روش مورداستفاده قرار مي گيرد. • Appendix C. Filter Paper Specifications • (1) Filter paper should be made of 100% pure cotton • (2) Basis weight should be 110 lb ± 5% per ream (179 g/m2 • ± 5%). A ream is defined as 500 sheets • 24" x 36" (ASTM D646-96). • (3) The pH should be 5.7 to 7.5 (Test method ISO 6588:1981). • (4) Ash %: 0.1% maximum (Test method A of ASTM D586-97a) • Whatman 903 Typical Properties:Basis Weight (g/m2) Range:170 – 188 • Serum Uptake Intact Red Blood Cells (μl 1/8“ disc) Range:1.37 – 1.71 • Blood Spot Diameter (mm/100 μl) 15 – 17 • Blood Absorption Time (seconds/100 μl) 5 – 30

41. تضمين كيفيت فيلتر پيپر پس از چاپ • طبق برنامه هاي استاندارد CLSI چاپ نامناسب اطلاعات دموگرافيك بيمار روي فيلتر پيپر باعث فشار خيلي زياد به كاغذو باعث زمانهاي جذب طولاني غير قابل قبول ونيز باعث لايه لايه شدن لكه خوني مي شود. • استفاده از يك شماره ساخت و يك توليد كننده ، تاثير بالقوه فيلتر پيپر بر روي آزمايش در تمامي نمونه ها و كاليبراتورها به حداقل مي رسد • جوهر چاپ نبايد در روش آزمايش تداخل كندونيز اطلاعات قابل دسترس در مورد سازگاري تست با جوهر چاپ وجود داشته باشد. جوهر اختصاصي بايد براي چاپ بكار رود • در چاپ از ماشين تايپ يا پرينتر استفاده نگردد چون باعث فشار به كاغذ ميشود. • توليد كننده بايد ليست اطلاعات لازم جهت تاييد هموژن بودن يك شماره ساخت( از يك لكه تا لكه ديگر و از يك شيت به شيت ديگر) را بدهد • هر تكنيكي كه امكان خراش، فشار و دندانه دار كردن كاغذ شود نبايد بكار رود. • قبل از چاپ فشار به فيلتر پيپر وارد نگرددو هر ماده شيميايي كه مورد استفاده قرار مي گيرد نبايد تداخل در روشهاي آزمايش گردد

42. در پروسه چاپ كاغذ را تحت فشار غلتك جهت صاف شدن نبايد قراردادبه اين دليل از تيغ گيوتين استفاده گردد ويا هر وسيله اي كه فشار به كاغذ وارد نگردد. • چاپ ليتوگراف متد قابل قبول براي فيلتر پيپر نيست. • نيمه عمر كارتهاي غربالگري نوزادان چاپ شده 2 سال مي باشد واين كاغذ فاقد كربن حساس به تغييرات درجه حرارت مي باشد. • هنگاميكه كارتها از كارتن حمل و نقل خارج مي شودبايد در بسته بندي اصلي ذخيره شوند و بسته بندي فيلتر پيپر ها نبايد باعث فشار روي آنها گردد چون فشار زياد باعث تغيير مشخصات عمللكرد آنها مي گردد. • نوع جوهروچاپ كارتهاي خوني وبسته بندي كارتهاي خوني نبايد ايجاد يك مرز نشت ناپذير (غير قابل نفوذ)درگسترش خون و فشار به فيلتر پيپر شود.

43. تعيين آزمايشگاههای همکاردر تاييد آزمايشات تاييدی • ميزان جمعيت و پراكندگي آن،تعداد شهرستانهاي تابعه استان،ميزان فراخوان و فاصله شهرستانها از استان و يا شهرستان مجاور،تعداد مثبت نمونه های DBS ومسافت بین شهرها • نظارت مستمر بر عملكرد آزمايشگاههاي تائيدي(تکميل چک ليست و آناليز اطلاعات) سهولت دسترسي و كيفيت عملكرد آزمايشگاه انتخاب شده مهم است امکانات موجود در آزمایشگاهها بر اساس معیارهای تعیین شده آزمایشگاه مرجع سلامت (تهيه چک ليست آزمايشگاههای تاييدی) آموزش set up دستگاه HPLCو نظارت بر کليه آزمایشگا ههای دارای این دستگاه(برگزاري دوره آموزشي بر اساس استفاده از يك پروتكل درتاييد تشخيص وکنترل درمان بيماران فنيل کتون اوری • نمونه گيریاز وريد • ناشتا • نمونه مورد نیاز سرم یا پلاسما (ضد انعقاد هپارین) • جداسازي پلاسما از خون تام بايد حداکثردر مدت يک ساعت انجام گردد.پلاسماي بالاي بافي كوت (ليز پلاكت ولكو سيت ها باعث افزايش غلظت فنيل آلانين مي گردد) بايد برداشته شود واگر تا زمان انجام آزمايش مدت زيادي (بيش از 24 ساعت) طول مي كشد در دماي منهاي 20 درجه فريز شود • اندازه گيري‌پرولاكتين‌در پي‌كي يو غيركلاسيك

44. ميزان توليد و ترشح پرولاكتين از عوامل گوناگوني اثر مي‌ پذيرد پس در اندازه‌گيري آن دقت زيادي بايد به كار برده شود: • بيمار نبايد هيچ گونه دارويي مصرف كرده باشد . • خونگيري ساعت 8 صبح و به صورت ناشتا انجام گيرد • آزمایش معمولا 2 - 3 ساعت پس از بیدار شدن از خواب انجام می شود. • نظر به اينكه نيمه ‌ عمر پرولاكتين 30 دقيقه و ترشح آن به شدت از تنش) استرس) اثر مي ‌ پذيرد ، پيش از خونگيري ، بيمار به مدت نيم ساعت در محل آزمايشگاه استراحت كند. • تحريك پستان ‌ ها به هر دليلي باعث افزايش پرولاكتين مي ‌ شود . 36-24ساعت قبل تحریک نوک پستان انجام نشود. • هنگام خونگيري سعي شود رگ مناسبي انتخاب گردد. چون با چند بار ورود سوزن به رگ يا عضله، بيمار دچار تنش مي ‌ شود و سطح هورمون افزايش مي ‌يابد . • قبل از آزمایش از استرس شدید روانی و فیزیکی پرهیز شوداسترس از بيمار شدن، تروما به قفسه سينه، كار و مشكلات پرسنلي و حتي ترس از داشتن تست خون باعث افزايش متوسطي در پرولاكتين مي گردد. • مقدار پرولاكتين در طول روز متغير است بالاترين مقدار در ضمن خواب و بعد از بیدار شدن مختصراً مقدار آن بالامي رود. • واكنش تداخللي: استرس، حامللگي، خواب، تحريك نوك پستان و شير دهي افزايش دهنده پرولاكتين مي باشند

45. Post analytical جوابدهی • پاسخ مثبت آزمایشات غربالگری تلفنی و بسیار فوری (فراخوان مواردمشکوک با E.mail) • گزارش کامپیوتری نتایج آزمایشگاه • بایگانی مناسب نتایج آزمایشگاه وبايگانی نتايج سرمی آزمايشات تاييدی به روش سرمی و مقايسه آن با مقادير روش غربالگری (از گروه بيماريها درخواست شود) • مدت زمان جوابدهي 48ساعت از زمان تحويل نمونه به آزمايشگاه غربالگري • ذخيره کارتهای خونی فيلتر پيپر پس ازانجام آزمايشات غربالگری در فريزر منهای 20 درجه سانتی گراد • تهيه بانک نمونه DBSجهت کنترل کيفی در غلظت هاي مختلف • تفاوت درنحوه گزارش دهي ميزان فنيل آلانين با روش HPLCاز نظرواحد جواب آزمايش و ميزان نرمال آن • مواردي که آزمايش بايد دوباره تکرار شود باید مورد توجه ومشخص گردد • شرایط نگهداری و انتقال نمونه و... را آشکار می سازد.(جدول 1 در حدود 42% موارد جوابدهی مثبت اولیه ظرف مدت 96 ساعت تحقق یافته است و 58% پاسخ های اولیه پس از 4 روز دریافت شده اند (جدول شماره 2 ) حدود 33% از موارد بالای 20 فنیل آلانین ظرف مدت 72 ساعت تعیین تکلیف شده اند. ( جدول 5)

46. جدول 2 - جوابدهی مثبت اوليه طی 4 روز

48. اختلاف واحدهای گزارش دهی • واحد وزن در سيستم SI system Internationale)) مول است براي تبديل ميلي گرم در دسي ليتر به ميكرو مول كافي است از فرمول زير استفاده گردد • mg/dl مقدار *فاكتور(60.54 ) = مقدار(ميكرو مول درليتر) در واحد هاي SI • mg/dL * 60.5 = µmol/L • تفاوتي در گزارش مقادير نرمال در افراد تحت درمان با موارد تشخيص اوليه بيماري فنيل كتون اوري وجود دارد • در گزارش نتايج آزمايش فنيل آلانين ضريب تبديل واحد هاي mg/dlوmol/L µ ذكر شود. • قابليت عملکرد کيت خصوصا ميزان تکرارپذيري و درستي نتايج که برحسب CV% و %Bias بيان مي‌شود، از موارد ديگري است که حتما آزمايشگاهها بايد در نظر داشته باشند. براساس مراجع بين المللي مقدار خطاي مجاز براي اندازه‌گيري فنيل آلانين 21.6% مي‌باشد (8)، اين مقدار خطا بدين معناست که اگر مقدار واقعي فنيل‌آلانين در نمونه‌ايmg/dl 10 باشد، در بهترين شرايط که تمامي منابع ايجاد خطا تحت کنترل است، نتايج ممکن است در محدوده mg/dl 12-8 قرائت گردد. کارکنان آزمايشگاه غربالگري مي بايست ازميزان خطاي موجود در آزمايشگاه مطلع باشند و اين اطلاعات را در اختيار پزشکان و کارشناسان تغذيه قرار دهند.

49. پايان