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基因工程原理与技术 授课教师：林良斌 教授 参考书： 1 、 《 基因工程原理 》 吴乃虎 主编 2 、 《 植物基因工程原理与技术 》 王关林 主编

基因工程原理与技术 授课教师：林良斌 教授 参考书： 1 、 《 基因工程原理 》 吴乃虎 主编 2 、 《 植物基因工程原理与技术 》 王关林 主编. 第一章 绪论 第一节 基因工程的概念 基因工程 (gene engineering) 是现代生物技术的核心内容。 基因工程 是在分子水平上进行的遗传操作，是指将一种或多种生物体的基因分离出来或人工合成基因，按照人们的愿望，进行严密的设计和体外加工重组，转移到另一种生物体的细胞内，使之能在受体细胞中遗传表达并获得新的遗传性状而形成新的生物类型的生物技术。

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基因工程原理与技术 授课教师：林良斌 教授 参考书： 1 、 《 基因工程原理 》 吴乃虎 主编 2 、 《 植物基因工程原理与技术 》 王关林 主编

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  1. 基因工程原理与技术 授课教师：林良斌 教授 参考书： 1、《基因工程原理》 吴乃虎 主编 2、《植物基因工程原理与技术》 王关林 主编

  2. 第一章 绪论 第一节 基因工程的概念 基因工程(gene engineering)是现代生物技术的核心内容。 基因工程是在分子水平上进行的遗传操作，是指将一种或多种生物体的基因分离出来或人工合成基因，按照人们的愿望，进行严密的设计和体外加工重组，转移到另一种生物体的细胞内，使之能在受体细胞中遗传表达并获得新的遗传性状而形成新的生物类型的生物技术。 基因工程的核心内容是基因体外重组(DNA体外重组) 。 基因工程的四大要素(或基本条件)：目的基因、载体、工具酶、受体。 相关名词：遗传工程、基因工程、基因操作、重组DNA技术、分子克隆、基因克隆、基因无性繁殖。 基因工程的突出特点：打破物种间基因交流的界限。

  3. 第二节 基因工程的诞生与发展 基因工程诞生于1973年。 一、基因工程诞生的理论和技术基础 1、理论基础 ①DNA是遗传物质； ②DNA分子的双螺旋结构和半保留复制； ③遗传密码的通用性和遗传信息传递的方式。 2、技术基础 ①限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割； ②DNA连接酶的发现与DNA片段的连接； ③基因工程载体的构建与应用。

  4. 二、基因工程的诞生 1972年，美国斯坦福大学P. Berg研究小组的DNA体外重组实验。 1973年，斯坦福大学的S.Cohen研究小组的DNA体外重组和大肠杆菌转化实验。(见下两张幻灯片) 同年，加利福尼亚大学的H.Boyer也进行了类似的实验。 这一实验的成功标志着基因工程的诞生，因此，1973年被定为基因工程诞生的元年。

  5. pSC101 pR6-5 抗四环素 抗卡那霉素 EcoRI 抗卡那霉素基因 DNA连接酶 重组DNA分子

  6. 大肠杆菌 培养平皿 四环素\卡那霉素平板 四环素平板 卡那霉素平板

  7. 三、基因工程的发展 分为艰难阶段、逐渐成熟阶段、迅速发展阶段、鼎盛 发展阶段。 1、基因工程的艰难阶段(1973~1976，载体和受体系统的安全性改造) 基因工程的安全性问题，导致许多国家限制基因重组的实验。 2、基因工程的逐渐成熟阶段(1976~1982，基因工程药物的研制) 1976年, Genentech (Genetic Engineering Technology)公司成立(by Robert Swanson and Herb Boyer)。 1977年Boyer等首先将人工合成的生长激素释放抑制因子14肽的基因重组入质粒，成功地在大肠杆菌中合成得到这14肽(见下图)； 1978年Itakura（板仓）等使人生长激素191肽在大肠杆菌中表达成功； 1979年美国基因技术公司用人工合成的人胰岛素基因重组转入大肠杆菌中，并通过发酵生产人胰岛素。从而揭开了基因工程产业化的序幕。

  8. SS基因 生长激素释放抑制因子 + 目的基因 基因载体 重组体 大肠杆菌 从动物脑中提取5mg---50万只羊脑 9升工程大肠杆菌 培养液

  9. 3、基因工程的迅速发展阶段(1982~2000，动植物基因工程育种与基因治疗)3、基因工程的迅速发展阶段(1982~2000，动植物基因工程育种与基因治疗) 发展了一系列新的基因工程操作技术，构建了多种转化原核生物和动物、植物细胞的载体。 1982年首次通过显微注射培育出世界上第一个转基因动物——转基因小鼠。 1983年采用农杆菌介导法培育出世界上第一例转基因植物——转基因烟草。 1990年美国政府首次批准一项人体基因治疗临床研究计划，对一名因腺苷脱氨酶基因缺陷而患有重度联合免疫缺陷症的儿童进行基因治疗获得成功。 1991年，美国提出人类基因组计划并实施。

  10. 4、鼎盛发展阶段(21世纪) 2005年完成人类基因组计划。 至今，基因工程药物上市的有几十种，上百种正在进行临床试验。 转基因植物迅速发展，目前至少有150种转基因植物问世。 自从1986年抗除草剂转基因烟草被首次批准进入田间试验以来, 至今国际上已有30个国家批准上千例转基因植物进入田间试验, 涉及的植物种类达50多种。 自从1994年转基因延熟西红柿获准上市以来，目前至少有51种转基因植物上市。

  11. 据国际有关方面预测，到 20l0 年，全世界转基因食物的种植面积将增至 10000 万公顷。

  12. 虽然转基因动物比转基因植物诞生早，但其发展比转基因植物要慢得多！主要原因是动物转基因技术操作烦琐、困难，动物细胞培养要求高，不易再生出个体。虽然转基因动物比转基因植物诞生早，但其发展比转基因植物要慢得多！主要原因是动物转基因技术操作烦琐、困难，动物细胞培养要求高，不易再生出个体。 荷兰的GenPharm公司用转基因牛生产乳铁蛋白，预计每年从牛奶生产出来营养奶粉的销售额是50亿美元。

  13. 英国罗斯林研究所研制成功的转基因羊，其乳汁中含有α[1]-抗胰蛋白酶，可治疗肺气肿病。这种病在北美比较常见，病人以前只能依赖于注射人的α[1]-抗胰蛋白酶做替代疗法， 价格昂贵，而现在用转基因羊来生产，每升这种羊奶可售6000美元。

  14. 中国工程院院士曾溢涛教授研究小组获得5只转基因山羊。其中一只奶山羊的乳汁中，含有堪称血友病人救星的药物蛋白——有活性的人凝血因子Ⅸ。中国工程院院士曾溢涛教授研究小组获得5只转基因山羊。其中一只奶山羊的乳汁中，含有堪称血友病人救星的药物蛋白——有活性的人凝血因子Ⅸ。

  15. 第三节 基因工程研究的主要内容 一、基因工程研究的主要内容 主要包括：基础研究（载体的研究、受体系统的研究、目的基因研究、工具酶的研究、转化方法的研究、生物基因组学研究）和应用研究等。 1、载体的研究 构建各种用途载体及提高外源基因表达的效率。 2、受体系统的研究 包括细菌、真菌、植物、动物。 受体系统的安全性及转化效率。 3、目的基因研究 目的基因的分离、克隆及改造。

  16. 4、工具酶的研究 开发新的工具酶。 5、转化方法的研究 开发各种受体细胞的高效转化方法。 6、生物基因组学研究 具有重要经济价值的各种生物的基因组测序、挖掘新的基因等。 7、应用研究 包括基因工程药物研究、基因疫苗研究、转基因植物研究、转基因动物研究以及在酶制剂工业、食品工业、化学与能源工业及环境保护等方面的应用。

  17. 二、基因工程的基本操作程序 ①分离获得带有目的基因的DNA片段及载体选择与构建。 ②限制性核酸内切酶分别切割外源DNA和载体。 ③通过DNA连接酶将外源基因DNA片段连接到载体上，形成重组DNA分子。 ④将重组 DNA分子引入到受体细胞(转化)。 ⑤带有重组体细胞(转化体)的扩增及选择培养。 ⑥转化体的鉴定，获得外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞。 ⑦目的基因的进一步研究分析，并设法使之实现功能蛋白的表达(基因功能研究或基因改造研究)。

  18. 第四节 基因工程的意义与发展前景 一、基因工程研究的意义 ①大规模生产其他生物体内含量极微但却具有较高经济价值的生物分子； ②设计构建新物种(新性状乃至全新物种)； ③搜寻、分离和鉴定生物体尤其是人体内的遗传信息资源(基因) 。 二、基因工程发展前景 基因工程问世以来短短的三十年，显示出了巨大的活力，基因工程的前景将更加灿烂辉煌。今后，基因工程的重点研究方向是基因组学、基因工程药物、动植物生物反应器和环保等方面。

  19. 第二章 基因工程的工具酶 工具酶是指基因工程操作中所使用的核酸酶类。根据其用途分为四类：限制性内切酶、连接酶、聚合酶、修饰酶。 第一节 限制性核酸内切酶 一、宿主的限制-修饰现象(见下图) 限制作用(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。这是维护宿主遗传稳定的保护机制。 修饰作用(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰，从而免遭自身限制性酶的破坏。这是宿主细胞识别自身遗传物质和外来遗传物质的作用机制。

  20. R/M系统 ①DNA甲基化酶 ②限制性核酸内切酶 R/M系统的作用 ①限制作用 ②修饰作用

  21. 1953年，Arber发现限制-修饰现象，预见限制性核酸内切酶的存在； 1970年，H.O.Smith从流感嗜血杆菌中分离出第一个II型限制性核酸内切酶Hind II。 Nathans首次用限制性酶切割SV40DNA。

  22. 根据限制-修饰系统的遗传分析，大肠杆菌K12有以下4种表型：根据限制-修饰系统的遗传分析，大肠杆菌K12有以下4种表型： ①rk+mk+：野生型，具有完整的限制和修饰功能。 ②rk-mk+：限制缺陷型，不能降解外源DNA，但具有修饰功能，这类突变株经常用于基因工程的受体。 ③rk-mk-：限制和修饰缺陷型，既无限制功能，又无修饰功能，也常用于基因工程的受体。 ④rk+mk-：修饰缺陷型，缺乏修饰自身DNA的功能，但具有限制功能，故也称为“自杀性表型”(suicide phenotype)。

  23. 二、限制性核酸内切酶的类型 限制性核酸内切酶是指一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链DNA的核酸内切酶。简称限制性内切酶或限制性酶，目前已经鉴定出三种不同类型。至今，已发现近4000种限制酶。 www.rebase.neb.com

  24. 三、限制性核酸内切酶的命名 1973年H.O.Smith和D.Nathams提出命名系统，1980年Roberts在此基础上进行了修改。 ①限制性核酸内切酶第一个字母(大写，斜体)代表该酶的宿主菌属名(genus)第一个字母；第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名(species)前两个字母。 ②第四个字母代表宿主菌的菌株名的第一个字母(小写，正体)或染色体外成分(质粒或噬菌体，大写，正体)。 ③若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示(正体)。 Haemophilus influenzaed 流感嗜血杆菌d株 HindⅡ Hind Ⅲ

  25. 四、II型限制性核酸内切酶的基本特性 1、II型限制性内切酶的识别序列 一般为4～6bp的回文序列。也有6bp以上的，如NotI，称为稀有切割限制酶。有些为反向重复序列(间断回文序列)，如SfiI。 有些II型限制酶的识别序列中，某一位或二位碱基并非严格专一，如Hind II可识别4种核苷酸序列。

  26. 2、II型限制性核酸内切酶的切割方式 大多数II型限制性核酸内切酶均在其识别位点内部切割双链DNA，水解磷酸二酯键中3’位的酯键，产生3’端为羟基、5’端为磷酸基团的片段。有三种切割方式： ①在识别序列的对称轴的5’末端切割，产生5’黏性末端， 如 EcoRI

  27. ②在识别序列的对称轴的3’端切割，则产生3’黏性末端， 如PstI

  28. ③在识别序列的对称轴上切割，产生平头末端，如 PvuII 有些识别序列为间断型回文序列的II限制酶，其切点位于不确定核苷酸中，如：Bgl I GCCNNNN↓NGGC Sfi I GGCCN NNNN↓NGGCC Xmn I GAANN↓NNTTC

  29. 有极少数II型限制性核酸内切酶的切割位点远离识别序列，如 Mbo II识别 GAAGA序列，切割位点则是： 5’－ GAAGANNNNNNNN↓ N－ 3’ 3’－ CT TC TNNNNNNNN↓ N－5’ 同裂酶是指识别序列相同、切割方式相同或不同、来源不同的II限制性核酸内切酶。 如：HpaII与Msp I的识别序列和切割位点都相同(C↓CGG)，但 Msp I还可以识别已甲基化的序列CmCGG； SmaI (CCC↓GGG)和 Xma I (C↓CCGGG)，识别序列相同，但切割位点不同。

  30. 同尾酶是指来源各异、识别序列不同，但产生相同的黏性末端的II限制性核酸内切酶。同尾酶是指来源各异、识别序列不同，但产生相同的黏性末端的II限制性核酸内切酶。 如： BamHI (5’-G↓GATCC-3’ ) Bgl II (5’-A↓GATCT-3’) 3、II型限制性核酸内功酶不具有甲基化功能 如 EcoRI限制性核酸内切酶与 EcoRI甲基化酶，两者均识别GAATTC序列，而前者能对G↓AATTC序列进行切割，后者的作用是使第二个A甲基化。目前已经分离到许多II型限制性核酸内切酶与其对应的甲基化酶。

  31. 4、II型限制性核酸内切酶对单链DNA的切割 有一些II限制性核酸内切酶，除双链DNA外，还可以特异识别并切割单链DNA的相应位点，只是切割效率比较低。如Hha I能切割单链噬菌体ФX174和 M13mp18 DNA，只是切割单链 DNA比切割双链 DNA效率低50％。 五、Ⅱ限制性核酸内切酶的主要用途 ①产生具有相同粘性末端的DNA片段，以便重组克隆； ②建立DNA分子的限制酶图谱； ③构建基因文库； ④构建载体。

  32. 六、II型限制性核酸内切酶的酶切反应 1、标准酶解体系的建立 反应体积一般为20μl(根据DNA量可适当扩大)。 ① 10×酶切缓冲液2μl(大部分酶反应缓冲液基本相似： 50mmol/LTris-HCl pH7.0~7.5、0~100mmol/L NaCl、 10mmol/L MgCl2、 1mmol/L DTT) ②酶(根据酶活力大小及工作性质确定酶量，不超过反应总体积10％ ③DNA样品(μg~mg) ④无菌水 限制性核酸内切酶的一个活力单位(U)为：在合适的温度和缓冲液中，在 20 μL反应体系中，1h完全降解 1ug 标准DNA所需要的酶量。

  33. 2、酶解反应 ①混匀 ②酶解(温度、时间) ③酶解鉴定 ④终止 a、加EDTA至10mmol/L； b、加SDS至0.1%(W/V)； c、65℃水浴保温20min(有些最适反应温度较高的酶不能使之完全失活，如 Ace III、BelI、BstXI、TaqI)； d、酚/氯仿抽提酶，乙醇沉淀DNA 3、限制性核酸内切酶对DNA的不完全酶解(见下图) 不完全酶解对于构建物理图谱和基因组文库是非常必要的。其方法有减少酶量、增加反应体积、缩短反应时间和降低反应温度等。

  34. incomplete digestion Sma I complete 1+2+3 1 2 3 incomplete 1+3 1 3 2

  35. 4、Ⅱ限制性核酸内切酶操作的注意事项 ①商品化的限制性核酸内切酶均为浓缩液，每次操作时应使用新的吸头去取酶； ②加入酶的体积应不超过总体积的10%，否则酶液中的甘油浓度超过5%时将会抑制酶的活性； ③整个操作应在0℃进行，即在冰浴中进行，而且是在加入其它试剂之后，最后加入酶； ④尽可能使反应体积减到最小，即尽可能少加水； ⑤当切割大量DNA时，通常采用延长反应时间，减少酶的用量； ⑥当DNA需2种或以上酶切时，应用通用缓冲液。若没有通用缓冲液时，只有用1种酶切完后，纯化酶切产物，再进行下一个酶切反应。

  36. 七、影响限制性核酸内切酶活性与酶切效果的因素七、影响限制性核酸内切酶活性与酶切效果的因素 1、酶的纯度； 要求不存在其他核酸内切酶或外切酶的污染。 2、DNA样品的纯度； DNA样品中的蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高NaCl等，都能抑制酶活性。 样品中DNase会降解DNA，影响酶切。 3、酶切反应的温度、时间； 多数II型限制酶最适反应温度是37℃，但SmaI为25℃或30℃，SfiI为50℃，TaqI为65℃。 反应温度过高或过低都会影响酶活性，甚至导致酶失活。

  37. 4、DNA的甲基化程度； 限制性核酸内切酶不能切割甲基化的核苷酸序列。 这一特性有特殊用途：①改变某些限制性核酸内切酶的识别序列；②产生新的限制酶识别序列；③保护限制性核酸内切酶的切点；④利用一些同裂酶对甲基化的敏感性不同，研究细胞DNA位点专一性甲基化的程度和分布。 大肠杆菌中的DNA腺嘌呤甲基化酶(dam)在5’GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、MboI 等，但BamHI、Bgl II、Sau3A I不受影响。 大肠杆菌中的DNA胞嘧啶甲基化酶(dcm)在5’CCAGG3’或5’CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoRII等，但Bgl I、KpnI不受影响。 采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒DNA，可防止DNA的甲基化。

  38. 5、DNA分子的构型 限制性内切酶对不同构型DNA分子的酶切效果是不同的，例如超螺旋DNA酶解所需要的酶量，比线性DNA酶解所需要的酶量高许多，甚至可高达20倍。 有些限制性核酸内切酶对于同一 DNA分子上不同位置的识别序列，切割效率明显不同。例如， EcoRI、Hind III对λDNA的酶切。 6、反应缓冲液 主要成分：pH (Tris-HCl)、离子强度(NaCl)、Mg2+； 辅助成分：β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)防止酶氧化；牛血清蛋白(BSA)组分V对于某些酶是必需的，可防止酶在低浓度蛋白质溶液中变性。

  39. 星号活性是指在极端非标准反应条件下，限制性核酸内切酶能切割与特异识别序列相似的序列的特性。星号活性是指在极端非标准反应条件下，限制性核酸内切酶能切割与特异识别序列相似的序列的特性。 例如EcoRI在高pH(＞8)、低盐(50mmol/L)和高浓度甘油(＞5％)存在的情况下，其识别序列由GAATTC改变为NAATTN。以EcoRI表示其星号活性。 引起星号活性的原因有：①高甘油含量，大于5%；②酶用量过大，大于100U/微克DNA；③低离子强度，小于25mmol/L； ④高pH，大于8.0；⑤含有机剂，如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺等；⑥Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二价阳离子的存在。 常发生星活性的内切酶有：EcoRI、HindⅢ、KpnI、PstI、SalI、HinfI等。

  40. 大肠杆菌和其他细菌：NAD+ 动物细胞和噬菌体：ATP 第二节 DNA连接酶 1967年几个实验室几乎同时发现DNA连接酶。 一、定义与反应机理 DNA连接酶是指能催化双链DNA分子内或分子间的5’-磷酸基和3’-羟基生成磷酸二酯键而使DNA链连接的一类酶。

  41. DNA连接酶 无连接 T4 DNA连接酶连接DNA/RNA杂合分子中DNA链的切口

  42. DNA连接酶的作用机理

  43. T4 DNA连接酶 DNA/RNA RNA 二、DNA连接酶的种类 1、T4 噬菌体DNA 连接酶(T4 DNA 连接酶) 平头末端的Km比黏性末端的Km高约1000倍。提高平头末端连接效率的方法：①加大酶浓度(10~100倍于粘性末端)； ②加大底物浓度； ③加入适量的一价阳离子(150-200 mmol/L NaCl)； ④加入低浓度的PEG(10%PEG8000)。ATP的最适终浓度为 0.5 mmol/L。

  44. E.coli DNA连接酶 E.coli DNA连接酶 无连接 DNA/RNA T4 RNA连接酶 NNNN pNp 2、大肠杆菌DNA连接酶 3、T4噬菌体RNA连接酶 用途：RNA末端标记

  45. 三、DNA连接酶的反应体系 DNA连接酶的活性单位较通用的是韦氏(Weiss)单位，一个韦氏单位是指在37℃，20 min内催化从γ,β-32P-ATP的焦磷酸根置换出1nmol32P所需要的酶量。 M-L单位：以d(A-T)n作为底物 黏性末端连接单位：以 λDNA/Hind III片段为底物 一个韦氏单位相当于0.2个M-L单位或者60个黏性末端连接单位。 反应体系：10μL或20μL，DNA片段，连接酶，Buffer，温度(12~16℃或<30℃)，时间(4~16h) Buffer：50mmol/LTris-HCl pH7.6，10mmol/L MgCl2， 0.5mmol/L ATP，5mmol/L DTT

  46. 四、影响连接反应的因素 1、DNA末端的浓度 连接产物的分子构型(线形或环状)与DNA浓度及DNA分子长度存在密切关系。在一定浓度下，小分子DNA片段进行分子内连接，有利于形成环化分子。对于长度一定的DNA分子，其浓度增加有利于分子间连接。此外，分子间连接还与两种片段的末端浓度的比例有关。原则上一种片段的浓度大于另一一种片段的浓，如：在克隆中，插入片段:载体片段=2:1。 2、反应温度 介于最适温度与其Tm之间。＞30℃会导致T4 DNA连接酶的不稳定。 3、ATP浓度 ATP最适的终浓度为0.5mmol/L，浓度过高会抑制连接。

  47. 第三节 DNA聚合酶 DNA聚合酶分为：①依赖于DNA的DNA聚合酶；②依赖于RNA的DNA聚合酶。 常用的DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶I、Klenow片段酶、T4噬菌体DNA聚合酶、T7噬DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、逆转录酶。

  48. 5’→3’聚合酶活性 5’→3’外切酶活性：双链DNA带磷酸基团的5’端或 DNA/RNA杂合分子中的RNA5’端 3’→5’外切酶活性 DNA Pol I 一、大肠杆菌DNA聚合酶I 切口平移作用

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