牛肠道疾病的一种新病原鉴定

1. 牛肠道疾病的一种新病原鉴定 吴清民 国家肉牛产业技术体系疾病控制研究室 中国农业大学动物医学院

2. 临床上牛肠道疾病包括传染性疾病和非传染性疾病，病因复杂，是严重制约我国养牛业发展的一个重要的因素。临床上牛肠道疾病包括传染性疾病和非传染性疾病，病因复杂，是严重制约我国养牛业发展的一个重要的因素。 • 由传染性因素所致的牛肠道传染病-腹泻，其病原多样，临床上以严重腹泻、脱水和高度死亡为特征。 • 常见腹泻类疾病主要有沙门氏菌病、大肠杆菌病、牛副结核病、牛弯曲菌病、球虫病、隐孢子虫病、牛病毒性腹泻、牛细小病毒病、牛轮状病毒病、牛冠状病毒病等。 牛腹泻类疾病概述

3. 牛沙门氏菌病 • 流行病学：各种年龄，但幼龄更易感，以2～6周龄犊牛易感性最高。妊娠可流产。患病动物和带菌者是主要传染源。一年四季均可发生。呈散发或地方流行性。 • 临床症状 • 急性型：突然发病、高热（40～41℃）、精神沉郁、食欲废绝、产奶量下降。不久即开始下痢，粪便呈水样，恶臭，带血或含有纤维素絮片。下痢开始后体温降至正常或略高。病程持续4～7天。不经治疗或治疗不当死亡率可高达75%，而经治疗后，死亡率可降至10%。病牛表现毒血症症状，脱水、消瘦。持续10～14天粪便稀软，一般需2个月才能完全康复。妊娠母牛感染后可发生流产。 • 犊牛 有些犊牛在生后48小时内开始拒食、卧地，并迅速出现衰竭等症状，常于3～5天内死亡。但多数犊牛则于10～14日龄后发病，体温升高（40～41℃），24小时后排出灰黄色液状粪便，并混有粘液和血丝，通常于发病后5～7天内死亡，病死率可达50%。病期延长时，腕和跗关节可能肿大，有的还有支气管炎和肺炎等症状。

4. 牛大肠杆菌病 • 流行病学：病原存在于成年牛肠道和周围环境。消化道传染，也可经脐带感染。该病多见于初生犊牛，尤其2～3日龄犊牛最为易感，故又成为犊牛白痢。 • 临床症状: 潜伏期短，一般为几小时至十几小时。 • 败血症型 产后3天内犊牛。病初体温升高至40℃，食欲降低或废绝，随后腹泻，很快脱水，数小时至1天内因急性败血症死亡。病死率可达80％以上。病程稍长者，可能并发脐炎、关节炎或肺炎，幸存者生长发育受阻。 • 肠毒血症型 生后7天内犊牛，通常不出现明显症状突然死亡。有症状者则为典型中毒症状，如体温正常或稍高，初期兴奋不安，随后转为沉郁甚至昏迷，然后进入濒死期。死前伴有剧烈腹泻，排出白色而充满气泡的稀粪。 • 肠炎型 7～10日龄犊牛，体温升高、食欲减退、喜躺卧，下痢，粪便初呈黄色粥样，随后变为水样、呈灰白色，并混有未消化的凝乳块、血液、泡沫，有酸败气味。后期病犊排粪失禁，尾和后躯染有稀粪。病程长的，可能出现肺炎或关节炎。治疗及时，一般可以治愈。如不及时治疗，常因虚脱或继发肺炎而死。个别病例也会自愈，但以后发育迟缓。

5. 牛弯曲菌性腹泻 • 流行病学：又名牛冬痢或黑痢，秋冬季节，出血性下痢。各品种和年龄均可发病，一般成年牛发病较重，犊牛则较轻。地方流行性。病后可获得一定的免疫力。 • 临床症状： 潜伏期为3～7天，突然发病，一夜间可蔓延20%牛群，2～3天可波及80%牛群。病牛排出恶臭水样稀粪，常带有血液。体温、脉搏、呼吸、食欲正常。病情严重者，表现精神萎顿，食欲不振，弓背寒战，虚弱无力。病程2～3天，治疗及时，很少发生死亡。

6. 牛副结核 • 流行病学：副结核分枝杆菌主要感染牛，特别幼年牛更易感染发病。病牛和隐性感染牛是传染源，流行特点是发展缓慢，病程长、发病率不高、病死率极高，一旦在牛群中出现则很难根除。怀孕、分娩、泌乳或营养缺乏等因素可促使发病。 • 临床症状：潜伏期长达6～12个月，甚至更长。有的幼年牛感染，到～5岁时才表现临床症状。病初往往无明显症状，以后症状逐渐明显，出现间歇性腹泻，逐渐变为经常性的顽固腹泻。粪便稀薄，恶臭，可带有气泡、粘液和血液凝块。早期食欲、精神都还正常，以后食欲减退，逐渐消瘦，眼窝下陷，经常躺卧，不愿走动。皮肤粗糙，被毛粗乱，下颌及垂皮水肿。体温常无明显变化。如给予多汁饲料可加重腹泻症状。如腹泻不止，一般经3～4个月，最后因腹泻衰竭而死。患病牛群因本病的死亡率可达10%。

7. 牛球虫病 • 流行病学：各品种，2岁以内犊牛发病率较高，死亡率20%～40%，而成年牛常呈隐性感染。一般多发生在4-9月份。潮湿多沼泽草场放牧牛群很易感染。冬季舍饲期间亦可能发病，主要由于饲料、垫草、母牛乳房被粪污染，使犊牛感染。牛群拥挤和圈舍卫生条件差时会增加发病机会。不同地区，不同牛群的球虫感染率及发病率不同。 • 临床症状：多见于2岁内犊牛，多急性，但也有慢性。 • 急性病期，通常为10～15天，个别1～2天死亡。病初表现为精神沉郁，被毛松乱，粪便稀薄稍带血液且具恶臭味。一周后，症状加剧，食欲废绝，消瘦，精神萎靡，喜躺卧，体温上升到40℃～42℃，瘤胃蠕动和反刍停止，排出带血的稀粪，其中混有纤维素性假膜，恶臭。病末期粪便呈黑色，几乎全是血液，体温下降，在恶病质状态下死亡。 • 慢性病例，病程长达数月，主要表现下痢和贫血，如不及时治疗，亦可发生死亡。

8. 牛隐孢子虫病 • 流行病学：粪-口途径感染，宿主范围广泛；发病率很高但死亡率差别很大。100日龄以内幼畜尤其4～30日龄犊牛最易感染。国外报道犊牛(4-17日龄左右)发病率达50%以上，国内在北京、湖南、河南等省市调查的感染率为5.3%-40%，牛病程2～14天，死亡率16%～40%。 • 临床症状：食欲下降、腹泻、脱水是本病的主要特征。若单独感染腹泻可持续7天以上，继发感染或者混合感染则会出现脱水、酸碱失衡、腹泻等。犊牛感染最为严重，主要表现精神沉郁，厌食，腹泻，粪便带血和含大量纤维素；发育迟缓，进行性消瘦和减重甚至死亡。其中鼠隐孢子虫可引起中等程度的腹泻，小隐孢子虫可引起水样腹泻。

9. 牛轮状病毒病 • 流行病学：1～7日龄内新生犊牛。患病动物和隐性感染者是主要传染源。污染的饲料、饮水、垫草及土壤等媒介经口传播。多发生在晚秋、冬季和早春。寒冷、潮湿、不良卫生条件、劣质饲料和其他疾病的等均对该病严重程度和病死率影响很大。 • 临床症状：最早病例见于生后12小时，最迟也在数周以内终止。人工感染潜伏期是18～24 小时。症状以突然腹泻开始，病犊精神萎顿，体温正常或略有升高。若体温降至常温以下则是死亡的征兆。厌食和腹泻，粪便黄白色液状，有时带有粘液和血液。腹泻时间延长，则脱水明显。病死率可达10～50%，死亡的原因多是急性脱水或酸中毒。病程1～8天。若继发感染大肠杆菌则预后不良，致死率增高。

10. 牛病毒性腹泻-黏膜病 • 流行病学：各种年龄都易感、以幼龄牛易感性最高。病牛分泌物、排泄物、血液和脾脏等都含有病毒，主要传播途径是消化道和呼吸道，也可经胎盘垂直传播。以冬春季节多发。新疫区急性病例多，病死率可达90%～100%，老疫区急性病例少，但隐性感染高达50%以上。 • 临床症状：潜伏期7～14天。临床上牛群多数表现为隐性感染，但小牛症状严重。 • 急性型 常见于幼犊，死亡率很高，腹泻是特征性症状，可持续1～3周。稀粪呈水样初期淡黄色，后期常伴有肠粘膜和血液，水样、恶臭，有大量粘液和气泡。体温升高达40～42℃，流鼻汁、咳嗽、呼吸急促、流泪、流涎、精神萎顿等，以后口腔粘膜发生糜烂或溃疡持续4～7天，同时白血球减少。 • 慢性型 出现间歇性腹泻，病程较长，一般2～5个月，病牛被毛粗乱、消瘦，生长发育受阻，有的出现跛行。 • 妊娠母牛常发生流产，或产下有先天性缺陷犊牛。最常见的缺陷是小脑发育不全。患犊表现轻度的共济失调、完全不协调或不能站立。有些患牛失明。

11. 牛冠状病毒病 • 流行病学：多见于1～9日龄乳用犊牛，肠炎严重程度与犊牛日龄、免疫状况、病毒毒株和感染剂量有关。常呈地方流行性，发病牛场常在几年内连续发生。消化道和呼吸道是主要传播途径。饲养管理差、寒冷、潮湿可促使本病发生。 • 临床症状：潜伏期短，约为1d左右 • 犊牛腹泻主要见于7～10日龄，吃过初乳或未吃过初乳的犊牛均可发病，前者病情较轻。病初，患犊精神沉郁，吃奶减少或停止，排淡黄色的水样粪便、内含凝乳块和黏液，严重的可出现发热、脱水和血液浓缩。腹泻持续3～6d，大部分犊牛可康复，如腹泻严重、治疗不适当可能死亡。若继发细菌感染，死亡率可超过50％。 • 成年奶牛可发生血痢，特征为突然发病，表现腹泻，便如黑血样，产奶量急剧下降，同时出现流鼻涕、咳嗽、精神沉郁和食欲不振，发病率可达50％～100％，但死亡率很低。

12. 牛肠道病毒感染 • 流行病学：牛肠病毒广泛存在自然界，主要流行肠病毒1型和2型。BEV-1宿主范围包括人、马、狗、牛、猪、兔、禽类、鹿、非洲羚羊、水牛、绵羊和山羊；BEV-2的宿主只有家养牛。在国外牛群中，牛肠病毒阳性率高达到17.6-80%。初生犊牛因饮用初乳导致抗体阳性率非常高。主要经过粪口途径传播。病毒在宿主的消化道中复制增殖。病毒对酸性环境耐受的特性使得病毒能在消化道中长期存活。感染动物粪便中存在相当高的滴度（105-1011/g）的病毒粒子。 • 临床症状：一般为隐性感染，下痢、肺炎、呼吸道症状和乳房炎较为常见。此外，繁殖障碍表现明显，如子宫内膜炎、不孕、流产和死胎。但大多数情况下，BEV一般为无症状感染，不会导致患畜健康严重受损。试验感染时，动物表现为轻度下痢和轻微呼吸道症状。下痢表现为水样腹泻，有泡沫，少数严重的还有鲜血。体温变化不明显，食欲下降，基本没有死亡，但产奶量大幅下降。约两周后康复，康复后大多数奶牛的产奶量不能恢复到病前的水平。

13. 牛肠病毒（Bovine Enterovirus）为小RNA病毒科成员。 • 无囊膜，直径为27-30nm。复制部位在胞浆，往往可见晶格样排列的病毒颗粒。 • 被黏膜或粪便包裹的病毒在通常的环境下对热稳定。对pH3及高盐环境耐受，对消毒剂不敏感。

14. 近年来北京部分牛场的产奶牛普遍（约80%）出现严重腹泻症状：水样腹泻，有泡沫，少数（10-15%）严重病牛粪便含有鲜血，体温变化不明显，食欲下降，基本没有死亡，但产奶量大幅下降（约30%）。近年来北京部分牛场的产奶牛普遍（约80%）出现严重腹泻症状：水样腹泻，有泡沫，少数（10-15%）严重病牛粪便含有鲜血，体温变化不明显，食欲下降，基本没有死亡，但产奶量大幅下降（约30%）。 • 病程两周左右，康复后大多数奶牛产奶量难以恢复到病前水平，特别是高产奶牛。据回顾性调查，该病两年发生一次。发病牛场采样分离到了一种牛肠道病毒。

15. 目的意义 • 本研究通过从临床上严重腹泻、血性下痢病牛直肠拭子中分离的一株牛肠道病毒2型分离株鉴定过程，介绍一种基于随机PCR 的未知病毒鉴定方法，为后期未知病原体分离鉴定奠定基础，同时也为牛肠病毒2型感染的诊断和控制提供了科学依据。

16. 病料采集和病毒分离 • 采集病牛直肠拭子，按常规方法处理备用。 • 培养MDBK细胞，待细胞单层生长至80%以上时，将处理后的病料接种到MDBK，37℃作用1h，弃病毒液，加含1%FBS的DMEM，于5%CO2培养箱培养观察记录细胞状况，当出现细胞病变（CPE）时收获病毒液，并连传3代制备毒种。

17. 病毒分离结果 正常细胞形态及感染后不同时间点的细胞病变 正常细胞 8h 16h 36h × 400

18. 1、 蚀斑纯化和病毒增殖 利用MDBK细胞，按照蚀斑纯化常规方法，将分离物进行纯化。将经过三次纯化的未知病毒再次接种细胞单层，37℃作用1h，弃病毒液，加含1%FBS的DMEM，于5%CO2培养箱培养观察记录细胞病变（CPE）。至CPE出现90%左右，收获病毒液。连续传毒3代后大规模增殖病毒。 2 、牛肾细胞（MDBK）TCID50测定 在96孔细胞培养板上培养BK细胞至单层后，吸弃培养液，分别接种增殖后的原液细胞毒和10-1~10-7稀释病毒液，病毒稀释液为基础培养基。对照组用基础培养基代替病毒液。每孔100µl，每组10孔，于CO2培养箱孵育1h。吸弃接种液，每孔加125 µl DMEM维持液，于CO2培养箱培养3d，观察细胞病变情况。

19. 1、病毒浓缩 在收集到的病毒上清中加入5％的PEG 6000，4 ℃搅拌过夜（约18 h）。4 ℃ 10000 rpm离心1.5 h，弃上清。沉淀用TNMC缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，100 mM NaCl，10 mM CaCl2，1mM MgCl2）悬浮，于4 ℃ 50000 rpm离心1 h，弃上清。沉淀用TNMC缓冲液重新悬浮，使其终体积为浓缩前的1%。 2、病毒提纯 在25℃下将CsCl配制成10%、20%、30%、40%、50%、60%密度梯度的匀浆液，用注射器小心吸取浓度最小的溶液加入离心管底，然后将注射器针头插入离心管底部依次加入较高的各个浓度（10%-60%），每个浓度500 µl。在离心管顶部加入1ml病毒液。水平转头4℃ 50000 rpm，离心24 h。收集离心后形成的各区带，用TNMC缓冲液稀释10或15倍，4℃ 50000 rpm离心1.5 h，以去除残余CsCl。

20. 病毒提纯结果 • 未知病毒细胞毒TCID50=10-4.05/0.1ml。 • 病毒液经过增殖、浓缩、氯化铯密度梯度离心，获得4条区带。

21. 病毒核酸型鉴定 2 病毒的理化特性鉴定 电镜照片 1 脂溶剂敏感性试验 3 耐酸性试验 4 胰蛋白酶敏感性试验 5 耐热性试验 6

22. 电镜样品制备方法 将未知病毒液接种已长成单层的MDBK细胞，并以维持液维持；16h后将细胞培养基弃去，用PBS（pH7.2， 0.1M）轻轻洗涤一遍；以0.25％的胰酶消化细胞，使之成为单细胞悬液；1000-3000rpm离心10min，弃去上清；以2.5％的戊二醛(PH7．4)前固定。用刮匙将样品取出并割成小块，PBS（pH7.2， 0.1M）洗涤20min；1%锇酸固定；PBS（pH7.2， 0.1M）洗涤20min；丙酮脱水（梯度30%，50%，70%，80%，90%，100%）每个梯度20min，脱三遍；环氧树脂包埋聚合；切片机超薄切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染色；透射电镜观察病毒粒子形态。

23. 电镜形态观察 电镜照片图组 1 电镜照片图组 2 电镜形态观察结果

24. 病毒核酸型鉴定 DNA抑制剂如5-氟尿嘧啶等进入细胞后发生磷酸化，参与新合成的DNA以代替胸腺嘧啶，产生无功能的分子，从而抑制DNA的合成，将此药物加于细胞培养物中，对DNA病毒有明显的抑制作用，而对RNA病毒没有或仅有极低的抑制作用。

25. 病毒核酸型鉴定试验方法 在6孔板内培养细胞至单层，稀释病毒液，使其分别为100~10-5六个稀释度。向1-6号板中分别加入100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5六个滴度的病毒液，7号板加入DMEM（病毒稀释液），每孔500 µl。在37℃ CO2培养箱中孵育1h。用PBS洗涤6孔板，每块板的三个孔加入含50 µg/ml 5-氟尿嘧啶的1%FBS DMEM维持液，另三个孔加入不含5-氟尿嘧啶的1%FBS DMEM维持液。置于37℃ CO2培养箱中孵育3d。按时观察细胞病变。

26. 病毒核酸型鉴定试验结果 • 接毒后随着时间的推移，1-6号板接毒孔相继出现细胞病变，病变程度随着稀释倍数增大而减弱，6号板细胞病变不明显。每块6孔板（接种同一稀释度病毒液）中，添加含5-氟尿嘧啶的维持培养液孔与不添加5-氟尿嘧啶的维持培养液孔相比，细胞病变出现时间及病变程度无显著差异。 • 7号板（不接病毒）中，所有培养孔均未出现细胞病变。 • 根据5-氟尿嘧啶对未知病毒的抑制滴度小于一个对数，可以判定未知病毒对DNA抑制剂不敏感，为RNA病毒。

27. 脂溶剂敏感性试验 某些病毒具有囊膜，脂质是其重要的结构成分，应用乙醚等有机溶剂除去脂质，将使这类病毒灭活，例如疱疹病毒、正粘病毒、副粘病毒和批膜病毒等。故脂溶剂敏感试验可检测出病毒是否具有囊膜。

28. 脂溶剂敏感性试验方法 于病毒液中加入AR级氯仿，使其终浓度为4.8%，置4℃振荡混合10min。500rpm离心沉淀5min，吸取上层液体，滴定病毒感染力。另外，以加入4.8%量PBS的病毒液作为对照，同样处理和滴定。氯仿处理病毒液的滴度比对照病毒液下降2个对数以上者，判断对氯仿敏感。滴度相差小于1个对数者，判为对氯仿不敏感。

29. 脂溶剂敏感性试验结果 • 将病毒经过氯仿处理后接种MDBK细胞， 细胞毒TCID50=10-4.02/0.1ml。 • 与未用氯仿处理的病毒的TCID50（10-4.05/0.1ml）相比，二者滴度相差小于一个对数，故判定未知病毒对氯仿不敏感，为无囊膜病毒。

30. 耐酸性试验 某些病毒耐酸，例如小RNA病毒科中的肠道病毒，但同科中鼻病毒和口蹄疫病毒却对酸敏感。因此耐酸性试验也是病毒鉴定上一个比较重要的项目。

31. 耐酸性试验方法 将病毒液等量分装于15ml离心管中。用0.1N的HCl将小瓶中的病毒液的pH调至3.0，并向另1个离心管内的病毒液加入相同于用酸量的灭菌的PBS做对照。置于37℃的恒温水浴锅或者室温感作1h，再用5.6%NaHCO3溶液将PH调回至7.2左右。此后将两瓶病毒液分别用敏感细胞测定感染力。如果试验组感染力比对照组感染力降低2个对数以上乃至完全灭活者，则证明该病毒对酸敏感。滴度相差小于1个对数者为耐酸。

32. 耐酸性试验结果 • 将病毒液经过HCl处理，再用NaCO3将pH调回至7.2后接种MDBK细胞，细胞毒TCID50=10-4.17/0.1ml。 • 与用等量PBS处理的对照组TCID50（10-3.77/0.1ml）相比，二者滴度相差小于一个对数，故判定未知病毒对pH3环境耐受。

33. 胰蛋白酶敏感性试验 灰质炎病毒、猪传染性胃肠炎冠状病毒等对胰蛋白酶具有较高的抵抗力。相反，某些病毒，例如痘病毒、呼肠孤病毒和疱疹病毒等却易被胰蛋白酶灭活。因此，胰蛋白酶试验也常用于一些病毒的鉴定。

34. 胰蛋白酶敏感性试验方法 于灭菌15ml离心管内，加入病毒液500µl，再加入溶于pH7.4PBS的1%胰蛋白酶溶液500 µl，使胰蛋白酶终浓度为0.5%，充分混合。置37℃作用1h，随即加入灭活的犊牛血清4ml，充分混合，终止胰蛋白酶的作用。另取同样的病毒液500 µl，加入pH7.4PBS液500 µl，混合和37℃放置1h后，加入灭活犊牛血清4ml作为对照。最后将上述两份混合液分别在BK细胞测定感染力。感染力比对照组降低2个对数以上，以至完全丧失感染力者，判为对胰蛋白酶敏感；滴度相差小于1个对数者，判为对胰蛋白酶抵抗。

35. 胰蛋白酶敏感性试验结果 • 将病毒经过胰蛋白酶处理后接种MDBK细胞，细胞毒TCID50=10-3.06/0.1ml。 • 与用等量PBS处理的对照组TCID50（10-3.17/0.1ml）相比，二者滴度相差小于一个对数，故判定未知病毒对胰蛋白酶不敏感。

36. 耐热性试验 不同病毒对不同温度的敏感度以及耐受时间不同，故可以通过热敏感性试验及结合二价阳离子保护性试验（二价阳离子例如MgCl2，能够明显提高某些病毒对50-55 ℃高温处理的抵抗力）对病毒进行鉴定。

37. 耐热性试验方法 1、对不同温度的耐受 将病毒悬液分为等量4管，分别置于50℃、60℃、70℃、80℃水浴1h，测定感染力。如果在某个温度下试验组感染力比对照组感染力降低2个对数以上乃至完全灭活者，则证明该病毒对此温度敏感。滴度相差小于1个对数者为耐受。 2、对50℃的耐受时间 将病毒悬液分为等量4管，置于50℃水浴分别感作5、10、15和30min，随后测定感染力。如果试验组感染力比对照组感染力降低2个对数以上乃至完全灭活者，则证明该病毒在此时间内对50℃敏感。滴度相差小于1个对数者表明病毒在此时间内对50℃耐受。

38. 耐热性试验方法 3、二价阳离子保护性试验 将MgCl2用蒸馏水配成1.1M溶液。另将病毒液分成两份，分别用1.1M MgCl2溶液和生理盐水（对照）作10×稀释，置50℃水浴感作1h后，在细胞培养物上滴定感染力，如果试验组感染力比对照组感染力提高2个对数以上，则证明MgCl2对病毒具备保护性。滴度相差小于1个对数者为不具有保护性。

39. 耐热性试验结果 1、对不同温度的耐受 分别将经过50℃、60℃、70℃、80℃处理1h的病毒，接种BK细胞，3天后观察均不引起细胞病变，由此可知50℃作用1h便可灭活病毒。 2、对50℃的耐受时间 分别将经过50℃处理5min、15min、30min、1h的病毒，接种BK细胞，3天后观察均不引起细胞病变。由此可知，50℃作用5min便可灭活裸露状态的病毒。

40. 耐热性试验结果 3、二价阳离子保护性试验 将MgCl2溶液处理的病毒液置于50℃水浴1h后接种MDBK细胞，细胞毒TCID50=10-5.06/0.1ml。 与未使用MgCl2溶液且经过同样高温处理的病毒（完全灭活）相比较，可以判定MgCl2溶液对处于50℃高温环境中的未知病毒具有保护力。

41. 理化特性鉴定总结 • 病毒核酸型鉴定——RNA（抑制滴度小于一个对数 ） • 脂溶剂敏感试验——无囊膜（TCID50：10-4.02/0.1mlVS 10-4.05/0.1ml） • 胰酶敏感试验——不敏感（TCID50：10-3.06/0.1mlVS 10-3.17/0.1ml） • 耐酸性试验——pH3耐受（TCID50：10-4.17/0.1mlVS 10-3.77/0.1ml） • 耐热性试验 —— 50℃作用5min灭活（TCID50：100/0.1mlVS 10-4.05/0.1ml） ——二价阳离子具有保护力（TCID50：10-5.06/0.1mlVS 100/0.1ml）

42. 排除可疑病毒 结合病牛症状及病毒核酸型，对描述相符的一些常见病毒进行检测排除。可以采用血清学试验、PCR检测等方法。

43. 可疑病毒排除试验方法 根据病毒引起牛腹泻的临床症状及核酸型判定结果，怀疑其可能为BVDV（病毒性腹泻病毒）、BCV（牛冠状病毒）、BRV（牛轮状病毒）感染。故合成这三种病毒的特异性引物对病毒进行扩增。引物序列如下： （1）BVDV引物 FBVDV：5’-CAT GCC CAT AGT AGG AC-3’ RBVDV：5’-CCA TGT GCC ATG TAC AG-3’ （2）轮状病毒引物 FBCV：5’-AgA ATT TCC gTT Tgg CTA-3’ RBCV：5’-Cgg TCA CAT CAT ACA ACT CT-3’ （3）冠状病毒引物 FBCV：5’-gAg CgT CCT TTg gAA ATC gT-3’ RBCV：5’-gCT TAg TTA CTT gCT gTg gC-3’

44. 可疑病毒排除结果（PCR检测） 扩增结果显示，可以排除此病毒为BVDV、BCV及BRV。 用BVDV、BCV、BRV特异性引物对未知病毒RT-PCR扩增结果 1. 用BVDV特异性引物对BVDV病毒株扩增产物（阳性对照） 2. 用BVDV特异性引物对未知病毒扩增产物 3. 用BCV特异性引物对未知病毒扩增产物 4. 用BRV特异性引物对未知病毒扩增产物 M. DNA分子量标准

45. 分子生物学检测方法 • 提取RNA（据理化鉴定结果） • 使用随机引物进行PCR或者RT-PCR • 回收目的片段 • 连接T载体 • 转化感受态细胞 • 蓝白斑筛选重组质粒测序 • 序列比对分析

46. 分子生物学检测 随机引物选择 随机引物PCR技术(random amplied poly morphic DNA，RAPD；arbitranly primed PCR，AP PCR)是由Welsh、Williams于1990年几乎同时建立起来的一项DNA多态检测技术。该技术以PCR为基础，利用一系列单一的人工合成的随机寡核苷酸链为引物，对所研究的基因组DNA进行PCR扩增。这一技术在物种鉴定、动植物分类、群体遗传学调查、遗传性突变基因的筛查、新病毒发现等方面得到广泛的应用。 本次试验选择锚定随机引物序列如下： RPAdP：5’-ggA CTg gCT CgA Tgg CTC NNN NNN N-3’ RPAP： 5’-ggA CTg gCT CgA Tgg CTC -3’

47. 回收500bp以上的条带 锚定随机引物扩增结果 电泳图显示，模板经随机引物扩增后其片段大小从几百至几千个碱基对不等，产物呈彗尾样拖带现象。 1. 用锚定随机引物对病毒提纯后区带1的扩增产物 2. 用锚定随机引物对病毒提纯后区带2的扩增产物 3. 用锚定随机引物对病毒提纯后区带3的扩增产物 4. 用锚定随机引物对病毒提纯后区带4的扩增产物 M.DNA分子量标准

48. 用锚定随机引物对重组质粒的PCR鉴定结果 回收目的片段 连接T载体 转化感受态细胞 蓝白斑筛选重组质粒

49. 重组质粒的双酶切鉴定结果

50. 序列比对结果 选择部分酶切鉴定为阳性的质粒送至公司测序，测序结果登陆NCBI进行比对。结果表明， 其与Bovine Enterovirus 同源性为68%-78%。其中，与Bovine Enterovirus type 2 strain 3A （complete genome ）同源性最高。 根据上述结果，怀疑此病毒可能为BEV-2，故设计合成特异性引物对其进行扩增。 引物序列如下： BEV-2-F：5’-ACg gAg TAg Atg gTA TTC CC-3’ BEV-2-R： 5’-CgA gCC CCA TCT TCC AgA g-3’ 目的片段约220bp左右。