Sequenzanalyse nach Sanger

Sequenzanalyse nach Sanger

Unter einer Sequenzanalyse versteht man ein technisches Verfahren zur Ermittlung der Abfolge von Nukleotiden in einem DNA-Abschnitt. lat.: sequi = folgen ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

Unter einer Sequenzanalyse versteht man ein technisches Verfahren zur Ermittlung der Abfolge von Nukleotiden in einem DNA-Abschnitt. lat.: sequi = folgen In der Regel verläuft diese in 4 Abschnitten ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? Vervielfältigung Gelelektrophorese Denaturierung Kettenabbruch-verfahren ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

Vervielfältigung Zu untersuchendes Stück der DNA wird mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion(PCR) vervielfältigt. 1. Schritt: Erwärmen 94oC

Vervielfältigung 2. Schritt: Zugabe von zwei verschiedenen Primern und Abkühlen auf 60oC. 94oC

Vervielfältigung 2. Schritt: Zugabe von zwei verschiedenen Primern und Abkühlen auf 60oC. 94oC 60oC

Vervielfältigung 2. Schritt: Zugabe von zwei verschiedenen Primern und Abkühlen auf 60oC. 60oC A

Vervielfältigung 3. Schritt: Erhitzen auf 78oC und Zugabe von Nucleotiden. 78oC 60oC A Beobachtung: Die Taq-Polymerase synthetisiert ausgehend von den beiden Primer den komplementären Strang

Vervielfältigung 3. Schritt: Erhitzen auf 78oC und Zugabe von Nucleotiden. 78oC A Vorgang startet nun erneut mit Schritt 1 aber mit dem Unterschied, dass nun gleichzeitig 2 DNA-Abschnitte dupliziert werden.

Vervielfältigung 1. Schritt: Erwärmen (Wiederholung …) 94oC usw. 94oC usw.

Vervielfältigung Nach einigen Durchläufen der PCR bei denen sich die Menge an DNA jeweils verdoppelt, liegen ausreichende Mengen der zu untersuchenden DNA vor.

Denaturierung 1. Schritt: Erwärmen um die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basenpaaren zu lösen 94oC T G A 2. Schritt: Zugabe von Natronlauge um eine erneute Zusammenlagerung zu verhindern. Die DNA liegt nun endgültig in Form von Einzelsträngen vor, die sich nicht mehr zusammenlagern können. 3. Schritt: Zugabe eines einzelnen Primers, der eine radioaktive Markierung besitzt und sich nur an den codogenen Strang anlagert. Der komplementärer Strang wird nicht benötigt!

Hybridisierung Damit sind nun automatisch drei Nucleotide bekannt. T C A Zum Versuchsansatz werden nun die Taq-Polymerase, die 4 Nucleotide und ein Abbruchnucleotid hinzugefügt. T G A A T A G C Bei einem Abbruchnucleotid wird am 3`- Ende der Desoxyribose die OH-Gruppe durch ein Wasserstoffatom ersetzt. Dadurch entsteht eine Didesoxyribose. An ihr ist keine Kettenverlängerung mehr möglich. Adenosinabbruchnukleotid Adenosinnukleotid 200 : 1 A A ddA dA Man gibt dA im Überschuss zu damit eine Kettenverlängerung möglich wird. Nur dA würde immer einen Kettenabbruch bei der ersten Thyminbasebewirken. H H OH H

Kettenabbruch-reaktion Ablauf: 1. Variante T C A T G A

Kettenabbruch-reaktion Ablauf 1. Variante T C A T G A

Kettenabbruch-reaktion Weitere Kettenverlängerung ist nicht möglich, daher erfolgt ein Kettenabbruch. Trennung der komplementären Stränge durch Temperaturerhöhung. Ablauf: 1. Variante T C A T G A A

Kettenabbruch-reaktion Ablauf: 1. Variante T C A T G A A

Kettenabbruch-reaktion Ablauf 2. Variante T C A T G A A

Kettenabbruch-reaktion Ablauf 3. Variante T C A T G A A

Kettenabbruch-reaktion Ablauf 3. Variante T C A T T T G G G A A A A A A Ergebnis nach 3 Durchläufen Nun wird das Experiment mit den restlichen 3 Abbruchnucleotiden (ddT, ddG,ddC) durchgeführt.

Abbildung aller möglichen Sequenz- Abschnitte. C G T T T T T T T T T T T T T T G G G G G G G G G G G G G A A A A A A A A A A A A A A A A C T C G C Könnte man diese optisch nach ihrer Länge sortieren ergäbesich die gesuchte DNA-Sequenz! G T

T C C A C G A T G T G T A G C A C G T T T T T T T T T T T T T T G G G G G G G G G G G G G A A A A A A A A A A A A A A A A C T C G C G T

Gelelektrophorese Bei der Gelelektrophorese werden die Bruchstücke nach Ihrer Länge aufgetrennt und durch ihre Radioaktivität sichtbar gemacht. Das Gel muss so engporig sein, dass der Unterschied in der Wanderungsgeschwindigkeit schon bei einem Nucleotid sichtbar wird. (Polyacrylamidgel). In die Taschen werden nun die Abschnitte, die mit einer dd-Abbruch- Base erhalten wurden eingefüllt ddA-Stücke ddG-Stücke ddC-Stücke ddT-Stücke Spannung wird angelegt DNA-Abschnitte wandern aufgrund der negativen Ladung der Phosphatgruppen zur Anode (+-Pol).

Gelelektrophorese Bei der Gelelektrophorese werden die Bruchstücke nach Ihrer Länge aufgetrennt und durch ihre Radioaktivität sichtbar gemacht. Das Gel muss so engporig sein, dass der Unterschied in der Wanderungsgeschwindigkeit schon bei einem Nucleotid sichtbar wird. (Polyacrylamidgel). In die Taschen werden nun die Abschnitte die mit einem dd-Stopper erhalten wurden eingefüllt ddA-Stücke ddG-Stücke ddC-Stücke ddT-Stücke Spannung wird angelegt DNA-Abschnitte wandern aufgrund der negativen Ladung der Phosphatgruppen zur Anode (+-Pol).

Gelelektrophorese Bei der Gelelektrophorese werden die Bruchstücke nach Ihrer Länge aufgetrennt und durch ihre Radioaktivität sichtbar gemacht. Das Gel muss so engporig sein, dass der Unterschied in der Wanderungsgeschwindigkeit schon bei einem Nucleotid sichtbar wird. (Polyacrylamidgel). In die Taschen werden nun die Abschnitte die mit einem dd-Stopper erhalten wurden eingefüllt ddA-Stücke ddG-Stücke ddC-Stücke ddT-Stücke Spannung wird angelegt DNA-Abschnitte wandern aufgrund der negativen Ladung der Phosphatgruppen zur Anode (+-Pol). Da die Primer radioaktiv markiert sind können die DNA-Fragmente über einen Röntgenfilm sichtbar gemacht werden.

Gelelektrophorese Auswertung Das kürzestes DNA-Stück läuft im Gel am Weitesten. Es hat als Abbruch-BaseCytosin. ddA-Stücke ddG-Stücke ddC-Stücke ddT-Stücke 3` Die komplementäre Base des codogenenStranges lautet also Guanin T C Das um ein Nukleotid längere DNA-Stück läuft im Gel am Zweitweitesten. Es hat als Abbruch-Base Guanin. G C Die komplementäre Base des codogenenStranges lautet also Cytosin. G usw. A T Da die Taq-Polymerase von3  5 synthetisiert kann man nun auch die Polarität der DNA direkt angeben. G T A C G 5`

Gelelektrophorese Häufig wird eine andere Art der Darstellung gewählt. Dabei verbindet man die einzelnen Basen mit Linien untereinander und speichert die dabei erhaltenen Kurvenverläufe als Kennlinie der gesuchten DNA-Sequenz ab. ddA-Stücke ddG-Stücke ddC-Stücke ddT-Stücke

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