Detoxikace endogenních a exogenních látek

1. Detoxikace endogenních a exogenních látek mirka.rovenska@lfmotol.cuni.cz

2. A) Detoxikace amoniaku • Amoniak pochází z katabolismu aminokyselin a ty hlavně z odbourávání proteinů – přijatých potravou i endogenních: • trávicí enzymy • proteiny pocházející z odloučených buněk povrchu GIT • svalové proteiny • hemoglobin • intracelulární proteiny (poškozené, nepotřebné)

3. Odstranění dusíku z aminokyselin

4. Amoniak musí být odstraňován: • Amoniak je toxický, zejména pro CNS, protože reaguje s 2-oxoglutarátem, a tak snižuje jeho dostupnost pro citrátový cyklus  kolaps CC a následně i syntézy ATP • Při poškození jater nebo vrozené metab. poruše (stoupá konc. amoniaku) se může objevit třes, nezřetelná řeč, rozmazané vidění, koma a smrt • Normální konc. amoniaku v krvi: 30-60 µM

5. Transaminace • Přenos aminoskupiny aminokyseliny na 2-oxokyselinu  původní AA se mění na 2-oxokyselinu a naopak:

6. pyruvát glutamát oxalacetát

7. Transaminaci katalyzují transaminasy (aminotransferasy) s koenzymem pyridoxalfosfátem: aminokyselina pyridoxalfosfát Schiffova báze

8. Hlavní transaminasy: • Alaninaminotransrefasa (ve svalu): AA + pyruvát  2-oxokyselina + Ala • Glutamátaminotransferasa: AA + 2-oxoglutarát  2-oxokyselina + Glu • Aspartátaminotransferasa: AA + oxalacetát  2-oxokyselina + Asp • Transaminace jsou většinou zvratné  mohou běžet oběma směry v závislosti na konc. reaktantů

9. Výsledek: • Většina transaminas používá jako oxokyselinu 2-oxoglutarát, v menší míře oxalacetát produkty jsou převážně Glu a Asp • Glu je buď oxidačně deaminován za vzniku NH3, který v játrech vstupuje do močovinového cyklu, nebo využit pro syntézy • Aspartát v játrech vstupuje do močovinového cyklu

10. Oxidační deaminace glutamátu • V mitochondriích • Glu + NAD(P)+ + H2O → NAD(P)H + H+ + NH4+ + 2-oxoglutarát • Reakce může v závislosti na konc. reaktantů běžet oběma směry – jak k tvorbě Glu, tak k uvolnění a detoxikaci amoniaku. • Reakci katalyzuje glutamátdehydrogenasa, která může využívat NAD+ i NADP+ • Uvolněný amoniak je detoxikován v močovinovém cyklu

11. Transport dusíku: 1) jako Gln • V tkáních je amoniak zabudován do Gln glutaminsynthetasou: Glu + ATP + NH4+  Gln + H2O + ADP + P • Gln je transportován do jater a ledvin a zde deaminován L-glutaminasou→ vzniká Glu a amoniak: • Glu může být oxidačně deaminován, amoniak je v ledvinách vyloučen močí, v játrech detoxikován v moč. cyklu – odstraňuje amidoskupinu, ne -aminoskupinu!!!

13. Gln v ledvinách • Část Gln se dostává do ledvin a je glutaminasou rozložena tady; přispívá i Gln tvořený v ledvinách • V ledvinách uvolněný amoniak nevstupuje do močovinového cyklu, nýbrž je vyloučen do moče • To má význam pro regulaci acidobazické rovnováhy a pH moče

14. Játra Sval Transport dusíku: 2) jako Ala • Hlavně ze svalu • Mj. v glukoso-alaninovém cyklu: • Pyruvát je ve svalu transaminován na Ala • Ala je krví přenesen do jater a přeměněn zpět na pyruvát • Amoniak vstupuje v játrech do močovinového cyklu, pyruvát do glukoneogeneze • Vytvořená glukosa je přenesena zpět do svalu

15. Ve stavu sytosti se absorbované AA ze střeva dostávají krví do jater a dalších tkání, kde jsou využity především k syntéze proteinů (v játrech zejména plasmatických):

16. Gln a Ala jsou hlavní přenašeče dusíku • Za hladovění některé tkáně (mozek, sval, ledviny) oxidují Val, Leu, Ile a zabudovávají dusík do Gln, Ala • Gln, Ala a další AA transportují dusík do jater, ledvin, střeva a buněk s rychlým obratem (leukocyty) pro biosyntézy (Nt), oxidaci, syntézu glukosy a ketolátek • Zbylý dusík je ve formě Ala přenesen do jater do moč. cyklu

17. Detoxikace amoniaku • a) zabudováním do Glu (glutamátdehydrogenasou) a Gln (glutaminsynthetasou): 2-oxoglutarát + NH4+ + NAD(P)H+H+  Glu + H2O + NAD(P)+ Glu + ATP + NH4+  Gln + H2O + ADP + P • Glu, Gln se pak využívají pro další syntézy: • Glu – syntéza Gln, Pro, Ala, Asp • Gln – syntéza bází NA • Transaminace Glu + oxalacetát → Asp + 2-oxoglutarát v játrech poskytuje Asp pro močovinový cyklus!!! • b) močovinový cyklus…HLAVNĚ

18. serindehydratasa – NH3 urokanát Zdroje amoniaku pro moč. cyklus: • Oxidační deaminace Glu, nahromaděného transaminacemi a glutaminasovou reakcí • Glutaminasová reakce – uvolňuje amoniak, který v játrech vstupuje do močovinového cyklu (v ledvinách do moče) • Katabolismus Ser, Thr a His rovněž uvolňuje amoniak: • Amoniak produkují také střevní bakterie Analogicky: Thr na 2-oxobutyrát

19. Močovinový cyklus • Detoxikace amoniaku probíhá v močovinovém cyklu,který přeměňuje amoniak na močovinu (vylučována močí) • V játrech, ve 2 kompartmentech: Mt matrix a cytoplasmě • V matrix mitochondrií probíhá oxidační deaminace Glu a uvolněný amoniak je zde přeměněn na karbamoylfosfát: NH4+ + HCO3- + 2 ATP  2 ADP + P+ • Karbamoylfosfát v mitochondriích reaguje s ornithinem za vzniku citrullinu, který je přenesen do cytoplasmy; regene-rovaný ornithin (krokem 5) je přenesen zpět do mitochondrií

20. Fumarate ← Glu + oxalacetát

21. V močovinovém cyklu se spotřebovávají 3 moly ATP na 1 mol močoviny: • 2 na tvorbu karbamoylfosfátu • 1 na tvorbu argininosukcinátu

22. Regulace na úrovni CPSI • Tvorbu karbamoylfosfátu katalyzuje karbamoylfosfátsynthetasa I (CPSI), jejímž allosterickým aktivátorem je N-acetylglutamát: • N-Ac-Glu je syntetizován z Glu a AcCoA, reakci stimuluje Arg • Větší odbourávání AA (tj. stoupá potřeba odstraňovat dusík)  stoupá konc. Glu (transaminacemi) a Arg  roste i koncentrace N-Ac-Glu  aktivace CPS I, a tím stimulace močovinového cyklu

23. Deficience enzymů močového cyklu • Vedou ke zvýšení hladin Gln a amoniaku v krvi • 1) N-acetylglutamátsynthetasa • podává se karbamoylglutamát – také aktivuje CPSI • 2) CPSI • podává se benzoát a fenylacetát, hippurát a Phe-Ac-Gln se vyloučí močí:

24. 3)Ornithintranskarbamoylasa – nejobvyklejší porucha • Léčba jako u 2) (tj. odstranění dusíku ve formě Gly a Gln) • 4) Argininosukcinátsynthetasa: v krvi se akumuluje citrulin a dostává se do moče (citrulinemie) • Je nutno dodávat Arg • 5) Argininosukcinátlyasa • Terapie jako u 2) + dodávání Arg • 6) Arginasa: vzácná porucha; Arg se akumuluje a je vylučován • Podává se benzoát a nízkoproteinová dieta obsahující esenciální AA s výjimkou Arg, příp. jejich ketoanalogy • Vždy se nasazuje dieta s nízkým obsahem dusíku

25. Další dusíkaté degradační produkty vylučované močí • Kreatinin – vzniká z kreatinfosfátu: • Kyselina močová – vzniká katabolismem purinových bází

26. B) Metabolismus xenobiotik • Léky, konzervanty, barviva, pesticidy… • Hlavně v játrech, dále ve střevech, ledvinách, plicích • Probíhá ve dvou fázích

27. Fáze 1 • Zavedení nové funkční skupiny nebo modifikace stávající • Probíhá hlavně v endoplasmatickém retikulu (ER) • Výsledek: • zvýšení polarity (tj. usnadnění exkrece) • změna biologické aktivity: • A) snížení biologické aktivity (toxicity) • B) aktivace: některé látky jsou naopak až fází 1 přeměněny na biologicky účinnou (toxickou) formu

28. Možné nežádoucí účinky aktivovaných xenobiotik • Cytotoxické působení, např. kovalentní vazbou na proteiny • Vazba na protein  následně rozpoznán jako antigen  tvorba protilátek poškození buňky • Karcinogeneze – fáze 1 aktivuje prokarcinogeny (např. benzpyren). Protektivně může působit epoxidhydrolasa v ER: přeměňuje vysoce reaktivní epoxidy na méně reaktivní dioly: epoxid diol

29. Reakce fáze 1: • Hydroxylace • Tvorba epoxidu • Redukce ketoskupin a nitroskupin • Dehalogenace

30. Hydroxylace • Hlavní reakce fáze 1 • Katalyzována cytochromy P450: • u člověka asi 60 různých isoforem; nejhojnější: CYP3A4 • jde o monooxygenasy: RH + O2 + NADPH + H+ ROH + H2O + NADP+ • Elektrony jsou z NADPH přeneseny na NADPH:cytochrom P450 reduktasu a tou na cytochrom P450 a dál na kyslík. Jeden kyslíkový atom je zabudován do substrátu. • Metabolizují nejen xenobiotika, ale též endogenní látky, např. některé eikosanoidy, steroidy!!!

31. CYP3A4 4…číslo isoformy v dané podrodině CYP = cytochrom P4503…rodina A…podrodina Isoformy cytochromu P450 • Hemoproteiny v endopl. retikulu nebo vnitřní mitoch. membráně • Nejhojnější v játrech a tenkém střevě, dále v plicích; v játrech je nejméně 6 isoforem a každá má širokou substrátovou specifitu • Označení isoforem – podle identity AA sekvence: • Některé polymorfní formy mohou mít sníženou aktivitu  vyšší hladina příslušných xenobiotik v těle • Některé isoformy metabolizují polycyklické aromatické uhlovodíky (PAHs) na karcinogeny

32. Většina isoforem je inducibilních: • Např. fenobarbitalem a jinými léky, ale také svými substráty • Mechanismus: nejčastěji zvýšená transkripce • Může vést k interakci s podávanými léčivy: • indukce dané isoformy lékem 1 (např. fenobarbitalem) zrychlí metabolismus léku 2 (např. warfarin) touto isoformou  pro žádaný účinek je nutno zvýšit dávku léku 2

33. Metabolismus ethanolu • Další dráha (~10-20%): isoforma cytochromu P450 CYP2E1: CH3CH2OH + NADPH+H+ + O2 → NADP+ + 2 H2O + CH3CHO Acetaldehyd se může dostat do krve a poškodit tkáně • CYP2E1 je indukován ethanolem a metabolizuje i některé karcinogenní složky tabákového kouře! – hlavně v játrech Většina acetátu vstupuje do krve a je (hlavně v kosterním svalu) aktivována na acetyl-CoA →CC

34. Fáze 2 – konjugace • Látky vzniklé ve fázi 1 jsou konjugovány s jinými molekulami: • glukuronátem • sulfátem • glutathionem • Konjugace ještě více zvýší rozpustnost ve vodě, příp. sníží aktivitu • Ve formě konjugátu jsou látky vyloučeny z těla buď žlučí (látky s Mr 300) nebo močí (látky s Mr  300)

35. Glukuronidace • Donorem glukuronátu je UDP-glukuronová kyselina: • Glukuronát může být připojen na kyslíkaté (O-glukuronidy) či dusíkaté skupiny (N-glukuronidy) • Jako glukuronidy jsou vylučovány např.: kys. benzoová, fenol, meprobamat, ale i endogenní látky – bilirubin, steroidní hormony glukuronát

36. Vylučování bilirubinu • Bilirubin je produktem katabolismu hemu hem

37. M: methyl, V: vinyl, CE: karboxyethyl (propionyl) transport do jater pomocí albuminu

38. hem→ biliverdin → bilirubin transport do jater (albumin) konjugace glukuronátem  bilirubindiglukuronid vyloučen do žluče bakterie v tlustém střevě uvolňují bilirubin z diglukuronidu a přeměňují ho na bezbarvé urobilinogeny většina je oxidována na pigmenty, které se vylučují stolicí (urobilin, sterkobilin) část je ve střevech reabsorbována, dostává se zpět do jater a opět je vyloučena do žluče malá část je ledvinami vyloučena do moče

39. Sulfatace • Některé alkoholy, arylaminy, fenoly, ale také steroidy, glykolipidy, glykoproteiny • Donorem sulfátu je PAPS (3´-fosfoadenosin-5´-fosfosulfát):

40. Konjugace s glutathionem • Glutathion (GSH) = -glutamylcysteinylglycin: • Konjugace s glutathionem: G–S–H + R → G–S–R + H+(R…elektrofilní xenobiotikum) • Konjugace několika potenciálně toxických xenobiotik s GSH zabraňuje jejich vazbě na DNA, RNA či proteiny, a tím i poškození buňky!

41. Další přeměny konjugátů s GSH: • Konjugát s glutathionem je dále přeměňován: • jsou odstraněny glutamyl a glycinyl z GSH • je připojen acetyl (z acetyl-CoA) na aminoskupinu Cys • vzniká kyselina merkapturová (konjugát acetylcysteinu), která je vyloučena močí kys.merkapturová

42. C) Metalothioneiny • Malé proteiny (~ 6,5 kDa) bohaté na cystein, jehož – SH skupiny vážou ionty kovů: Cu2+, Zn2+ , Hg2+, Cd2+ • V cytosolu buněk hlavně jater, ledvin a střev • Indukovány ionty kovů • Funkce: navázání kovů, regulace hladiny Zn2+, transport do místa potřeby (Zn2+)