G enetica bacteriană

1. Genetica bacteriană • studiază ereditatea şi variabilitatea la bacterii; • suportul material al eredităţii este reprezentat de genomul bacterian, suma genelor unuimicroorganism; • gena constituie unitatea funcţională de bază a informaţiei genetice;

2. Genetica bacteriană • genomul bacterian este reprezentat de • ADN cromozomal (include gene esenţiale) • ADN plasmidic (conţine gene care codifică caractere de tulpină); • genotip= totalitatea informaţiei înscrisă în genomul bacterian; • fenotip= suma caracterelor observabile consecutiv interacţiunii genotipului cu mediul ambiant.

3. Fenomenul de variabilitate genotipică • modificare bruscă, transmisibilă la descendenţi a unuia sau a mai multor caractere prin două mecanisme • mutaţia • transferul de ADN de la un donor la un acceptor. Variaţia fenotipică • indusă de interacţiunea genomului cu factori de mediu; • este reversibilă şi nu se transmite ereditar; • are la bază controlul transcripţiei genelor în ARNm şi traducerii în sinteza proteinelor, prin inducţia sau represia acestora.

4. Mutaţia • reprezintă o modificare în secvenţa nucleotidelor într-o genă, datorită unei erori în cursul replicării; • eveniment rar, spontan şi imprevizibil; • mutaţiile acumulate de-alungul a miliarde de ani, sub efectul selecţiei naturale, explică evoluţia speciilor;

5. Mutaţia • noile gene apărute prin mutaţie se numesc alele şi ocupă acelaşi locus genetic ca gena de origine; • mecanisme moleculare ale mutaţiei • substituţia unei perechi de baze printr-o altă pereche, cu înlocuirea unui codon printr-un alt codon • inserţia sau deleţia uneia sau a mai multor baze, cu decalarea citirii mesajului genetic.

6. Rata mutaţiei= probabilitatea de apariţie spontană a unei mutaţii într-o populaţie bacteriană; • rata mutaţiei este foarte scăzută (10-7 – 10-9) dar poate creşte în prezenţa unor agenţi mutageni (chimici saufizici). • Frecvenţa mutaţiei= proporţia unui anumit mutant într-o populaţie bacteriană; • frecvenţa mutantului poate creşte ca urmare a selecţiei • relative (mutantul are un timp de generaţie mai scurt) • absolute (prin prezenţa unui factor de mediu favorabil mutantului, dar defavorabil restului populaţiei).

7. Mutaţii bacteriene observate în laborator: • mutaţii privind morfologia coloniei bacteriene (variaţia S – R); • mutaţii nutriţionale (mutanţi auxotrofi – vezi LP); • mutaţii care duc la pierderea unor factori de patogenitate (mutanţi avirulenţi la S.pneumoniaecare şi-aupierdut capsula); • mutaţii care conduc la apariţia fenomenului de rezistenţă la antibiotice (atât ADN cromozomic cât şi cel plasmidic poate fi sediul unor asemenea mutaţii).

8. Transferul genetic • se realileazăîn sens unic, de la o bacterie donor la una receptor; • exogenot= materialul genetic transferat; • endogenot= materialul genetic propriu;

9. Transferul genetic • evoluţia exogenotului în celula receptor • recombinare: alinierea secvenţelor cu omologie structurală, urmată de substiutirea uneia sau mai multor gene între exo- şi endogenot; • integrareîn genomul bacteriei receptor (transpozoni, fagi); • menţinerea în poziţie extracromozomală dacă este un replicon (plasmide, fagi); • supus acţiunii endonucleazelor de restricţie ( informaţie genetică pierdută).

10. Mecanisme de transfer al exogenotului I. Transformarea • bacteria acceptor este capabilă să primească ADN exogen provenit din mediu, de la bacterii moarte (stare de competenţă); • exogenotul trebuie să prezinte o structură bicatenară şi să reprezinte nu mai mult de 1% din mărimea genomului bacterian; • fenomenul a fost descoperit prin experimentări pe şoarece cu S.pneumoniae, în 1928, şi explicat după două decenii mai târziu.

11. II.Transducţia • transfer de ADN bacterian prin intermediul bacteriofagilor transductori; • există două tipuri de transducţie • generalizată (transfer aleator al unui fragment din genomul bacterian); • specializată (transfer de gene localizate în cromozomul bacterian în vecinătatea locului de integrare a profagului).

12. Conversia lizogenă • Conversie lizogenă = informaţie genetică adiţională, de origine fagică, având asemănări cu transducţia specializată (toxigeneza tulpinilor de Corynebacterium diphtheriae, Streptococcus pyogenes etc).

13. III. Conjugare • transfer genetic consecutiv contactului fizic între două bacterii cu polaritate sexuală diferită; • bacteria donor(”sex masculin”) posedă un plasmid conjugativ (factorul F+) cu gene care codifică sinteza de pili sexuali, prin care se ataşează la receptori specifici de pe suprafaţa unei celule receptor ( F-, de “sex feminin”);

14. III. Conjugare • retragerea pililor aduce cele două celule în contact, prin puntea citoplasmatică care se stabileşte, urmând să fie transferat ADN plasmidic; • consecutiv acestui tip de conjugare rezultă două celule F(+) ; • plasmidul F poate purta gene adiţionale (ex. gene de Rla antibiotice) care pot fi transferate;

15. III. Conjugare • plasmidul F integrat în cromozom poate conduce la transfer de gene cromozomale (între o bacterie Hfr -high frequency of recombination - şi una F(-)); • transferul incepe din vecinătatea locului de inserţie a plasmidului F, care este ultimul transferat; • cel mai frecvent bacteria receptor ramâne F(-); • transferul de ADN la bacterii gram-pozitive este controlat de feromoni sexuali (molecule de suprafaţă. prin care celulele bacteriene aderă între ele).

16. Elemente genetice transpozabile • reprezintă segmente de ADN capabile să se excizeze şi apoi să se insere în acelaşi replicon (cromozom sau plasmid) sau în unul diferit, putând determina blocarea expresiei unei gene în care se inseră (factor mutagen); • are loc cu intervenţia unei enzime, transpozaza, fără să fie necesară omologia genetică.

17. Elemente genetice transpozabile • Tipuri de elemente transpozabile • secvenţe de inserţie (SI) constituite din gena care codifică transpozaza, flancată de repetări inversate, a 20-40 perechi de baze; • transpozoni, care posedă în regiunea centrală una sau mai multe gene care codifică anumite caractere (ex. rezistenţa la antibiotice), flancate de SI.

18. Patogenitatea bacteriilor • Patogenitate= ansamblul proprietăţilor biologice ale unui microorganism care îi permit să determine îmbolnăvirea gazdei. • Clasificarea bacteriilor în raport de patogenitate • nepatogene (prezenţa lor nu determină îmbolnăviri); • înalt patogene sau patogene primare (determină cel mai frecvent îmbolnăviri la gazda normoreactivă dar lipsită de apărare specifică); • condiţionat patogenesau oportuniste (prezente pe suprafeţele de înveliş, pot determina îmbolnăviri când: • apar disfuncţii ale barierelor de apărare antimicrobiană • variaţia genetică le conferă factori de patogenitate).

19. Atributele majore ale unei bacterii patogene • transmisibilitatea= posibilitatea de a trece de la o gazdă la alta; • infectivitatea= abilitatea de a pătrunde, de a persista prin depăşirea sau neutralizarea barierelor şi mecanismelor antimicrobiene, de a se multiplica şi de a invadaorganismul gazdei; • virulenţa= capacitatea microorganismului de a vătăma gazda.

20. I. Transmisibilitatea conferită de: • prezenţa endosporilor care asigură indefinit supravieţuirea în condiţii nefavorabile (specii Bacillus şi Clostridium); • rezistenţa la condiţii de desicaţie/uscăciune (Mycobacterium tuberculosis,Staphylococcus aureus, Corynebacterium diphtheriae etc);

21. I. Transmisibilitatea conferită de: • supravieţuirea şi chiar multiplicarea în medii umede, minimale nutritiv (specii din familia Enterobacteriaceae sau Pseudomonas aeruginosa); • adaptarea la transmiterea directă (ex. transmitere sexuală) sau prin vectori biologici (artropode hematofage) în cazul speciilor extrem de fragile în mediul extern (Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum, respectiv specii Rickettsia, Borrelia).

22. II. Infectivitatea 1. Depăşirea barierelor externe de apărare • discontinuităţi ale tegumentului; • discontinuităţi ale stratului de mucus (plăcile Peyer); • producere de neuraminidază ( hidroliza stratului de mucus); • forma spiralată şi mobilitatea (Vibrio cholerae, Helicobacter pylori, Campylobacter jejuni); • producere de urează (neutralizează bariera acidă gastrică , ex.Helicobacter pylori, H.heilmannii); • sinteza de bacteriocine (afectează bariera biologică a suprafeţelor).

23. 2. Menţinerea prin aderare la suprafeţele de înveliş • necesită participarea a doi factori: • adezină sau ligant – componente macromoleculare pe suprafaţa celulei bacteriene, • receptori celulari prezenţi pe suprafaţa celulelor gazdei; • adezinele şi receptorii interacţionează în manieră complementară şi specifică; • conferă rezistenţă la spălarea mecanică (prin secreţii sau excrete) sau prin mişcări peristaltice; • structuri de suprafaţă cu rol de liganzi: fimbrii, glicocalix, proteine de suprafaţă (proteina M, proteina F), acizi teichoici şi lipoteichoici.

24. Exemple: • S. aureus si T. pallidum se leaga de fibronectinăprin diferite proteine de suprafaţă; • S. pyogenes posedă: acizi teichoici, proteina M şi proteina F (ultima este ligant pentru fibronectina).

25. 3. Invazia • majoritatea bacteriilor îşi exercită efectul patogen prin invazia ţesuturilor, precedată de aderarea la suprafaţa mucoaselor; • invazia poate fi din: • aproape în aproape • pe cale limfatică • hematogenă • nervoasă; • bacteriile invazive sunt capabile să penetreze în celulele nefagocitare prin endocitoză, graţie unor proteine de suprafaţă – invazine;

26. 3. Invazia • unele bacterii posedă: factori de difuziune (hialuronidază, colagenază, fibrinolizine), exoenzime care degradează ţesutul conjuctiv care se opune invaziei (ciment intercelular, membrană bazală, depozite de fibrină, fascii). • Factori de difuziune (exoenzime: hialuronidaza – S. pyogenes, S. aureus; colagenaza– Clostridium, stafilochinaza, streptokinaza pentru stafilococi si, respectiv streptococi).

27. 4. Supravieţuirea în organismul gazdei • protecţia faţă de fagocite şi complement prin: • inhibarea chemotaxiei fagocitelor şi uneori a producerii şi eliberării lor din măduva hematogenă; • sinteza de polizaharide capsulare; • supravieţuirea şi multiplicarea în celulele fagocitare; • liza celulelor fagocitare (prin leucocidine); • eludarea supravegherii imune: • variaţia antigenică; • identitatea antigenică cu celulele gazdei; • diversitatea antigenică; • localizarea în situs-uri privilegiate anatomic sau celular; • supresia răspunsului imun.

28. Exemple: • inhibarea chemotaxiei fagocitelor (streptolizina distruge fagocitele); • S. aureus produce coagulaza legată cu producerea de fibrină: bacteria nu poate fi recunoscută de fagocite; • capsula cu rol antifagocitar (S. pneumoniae, H influenzae, K. pneumoniae, E coli, S typhi); • AgO – acţiune antifagocitară, împiedica activarea C’ • Proteina A a S. aureus; leagă IgG prin fragmen-tul Fc şi blochează fagocitoza mediată de opsonine.

29. bacterii facultativ intracelulare (Salmonella spp, Shigella, E. coli enteroinvaziv (ECEI), Legionella pneumophila, Neisseria spp, Mycobacterium spp, Bordetella pertussis) si obligator intracelulare (Rickettsiia spp, Chlamydia spp, Coxiella burnetii) rezistă acţiunii microbicide intrafagocitare; • leucocidine şi hemolizine produse de S. aureus, S. pyogenes, C. perfringenslizează leucocitele, respectiv eritrocitele.

30. eludarea supravegherii imune: • variaţia antigenică; • identitatea antigenică cu celulele gazdei; • diversitatea antigenică; • localizarea în situs-uri privilegiate anatomic sau celular; • supresia răspunsului imun.

31. b) Eludarea supravegherii imune • variaţia antigenică: infecţia gonococică; Borrelia recurrentis – febra recurentă; • localizarea in situs-uri anatomice (ex. accesul Ac dificil in LCR, articulaţii, vezica biliară) sau celulare privilegiate (e.g. bacteriile facultativ sau obligator i.c. nu sunt influenţate de Ac serici);

32. b) Eludarea supravegherii imune • identitatea antigenică: tulpinile K1 de E. coli au determinanţi antigenici comuni cu polisialozil-glicopeptidele cerebrale – nu sunt recunoscute cănonself – determină infecţii bacteriemice si meningite grave la nou-născut; ulterior, cantitatea acestor Ag-ne scade;

33. INFECTIVITATEA b) Eludarea supravegherii imune: • absorbţia Ac prin Ag solubile: • Ag capsulare solubile “neutralizează” Ac specifici; • proteina A a S. aureus inactivează parţial IgG; • producerea de IgA – protează (de cătreN. gonorrhoeae, N. meningitidis, H. influenzae, S. pneumoniae) - clivează specific IgA; • supresia răspunsului imun: rar implicate bacteriille (e.g. lepră, tuberculoză, cu activarea limf. T supresor).

34. Achiziţia de nutrienţi • necesarul de Fe în medii feriprive este asigurat prin: • sinteza de siderofori (enterochelină, aerobactin); • legarea transferinei sau lactoferinei la receptori de pe suprafaţă bacteriei; • reducerea Fe feric în Fe feros.

35. INFECTIVITATEA Achiziţia de nutrienţi: fierul. Fe complexat cu proteinele: hem şi feritină, intracelular; transferina – T şi lactoferina - L, extracelular. H. influenzae, N. meningitidis, N. gonorrhoeae, leagă, printr-un receptor de suprafata, direct L sau T, alte bacterii, (Vibrio cholerae) fixeaza hemul. Sideroforii (enterochelina, aerobactin) cu afinitate mare pentru Fe, îl deplaseaza din complexele proteice ale gazdei. Proteine ale ME au rol de receptori pentru complexul Fe-siderofori – favorizeaza pătrunderea Fe în celulă.

36. III. Virulenţa • reprezintă capacitatea microorganismelor de a vătăma gazda; • este un atribut de tulpină cuantificabil (DLM; DL50); • condiţii majore pentru recunoaşterea unui constituient celular ca factor de virulenţă (postulatele moleculare Koch) • genele de virulenţă sunt cel mai frecvent prezente pe elemente genetice mobile (plasmide, fagi,transpozoni).

37. Postulatele moleculare Koch: • factorul de virulenţă este prezent numai la tulpinile virulente; • inactivarea prin mutaţie a genei care-l codifică duce la pierderea virulenţei; • reversia la gena sălbatică restaurează virulenţa; • produsul genei induce, de regulă, un răspuns imun protector;

38. Mecanisme de lezare a gazdei • mecanisme directe • exotoxine, produse de metabolism bacterian de natură proteică, eliberate în mediul extracelular atât de bacterii gram-pozitive cât şi gram-negative; • endotoxine, prezente numai la bacterii gram-negative, eliberate numai în momentul lizei celulei bacteriene; • agresine, exoenzime capabile să determine alterări tisulare. • mecanisme indirecte • reacţii de sensibilizare de tip II, III sau IV (Coombs şi Gell) – vezi Imunologia

39. Proprietăţi comparative exotoxine endotoxine - în general termolabile - termostabile - intens antigenice- slab antigenice - pot fi transformate în anatoxine - nu pot fi transformate - DLM ng/Kg corp - DLM µg/Kg corp - acţiune specifică(enterotoxine, - acţiune nespecifică neurotoxine, citotoxine) (febră, leucopenie urmatăde leucocitoză, CID, şoc endotoxinic)

40. Definiţii • Antitoxine: Ac anti-toxine (terapie). • Anatoxine: toxine care prin tratare cu formol, la cald, pierd toxicitatea dar păstrează imunogenicitatea (vaccinare). • Endotoxinele sunt mai puţin imunogene (ex. si vaccinuri lipopolizaharidice)

41. Clasificarea exotoxinelor • citolitice • atacă fosfolipide din membrana citoplasmatică (fosfolipaze); • crează pori prin membrana celulară (hemolizine, leucocidine). • bipartite, constituite din două subunităţi • subunitaea B permite legarea toxinei la un receptor celular • subunitatea A, cu proprietăţi enzimatice, pătrunde în celulă acţionând asupra unor ţinte moleculare. • superantigene • activează limfocitele T prin legare simultană la receptori de pe suprafaţa acestora şi la CMH clasă II de pe suprafaţa macrofagelor • este stimulată eliberarea unor mari cantităţi de limfokine, mediatorii fenomenelor morbide.

42. Superantigene • activează limfocitele T prin legare simultană la receptori de pe suprafaţa acestora şi la CMH clasă II de pe suprafaţa macrofagelor • este stimulată eliberarea unor mari cantităţi de limfokine, mediatorii fenomenelor morbide.

43. Efecte biologice ale endotoxinelor • activarea complementului pe cale alternativă cu stimularea procesului inflamator; • fixarea pe suprafaţa macrofagelor, cu eliberare de citokine (IL-1, IL-6, IL-8, FNT etc), mediatori ai inflamaţiei şi şocului endotoxic; • activarea unor factori ai coagulării, care conduce la CID; • activarea plasminei, cu apariţia de hemoragii; • fixarea pe celule endoteliale cu, creşterea permeabilităţii vasculare. În infecţii cu bacterii gram-pozitive sau a.a.r., peptidoglicanul, acizii teichoici şi respectiv arabinogalactanul pot determina efecte endotoxină-like.