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超快速反相液相色谱填充柱 TSKgel Super-ODS. 北京康林科技有限责任公司 2003.04. 一、概述 二、柱规格 三、填料特性 四、色谱特性 五、影响分离效果的因素 六、应用 七、结论. 一、 概 述. 反相填充柱作为分离分析的重要手段，具有分离度高、分析样品范围广、操作方便等特点，其尺寸通常是指其填充物的微粒尺寸，目前一般约为 5 m ，这已显示了很高的理论塔板数。
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超快速反相液相色谱填充柱TSKgel Super-ODS 北京康林科技有限责任公司 2003.04
一、概述 二、柱规格 三、填料特性 四、色谱特性 五、影响分离效果的因素 六、应用 七、结论
一、 概 述 反相填充柱作为分离分析的重要手段，具有分离度高、分析样品范围广、操作方便等特点，其尺寸通常是指其填充物的微粒尺寸，目前一般约为5m，这已显示了很高的理论塔板数。 低能耗分离技术主要包括低流速分离技术(semi-micro application)和 缩短时间提高分析效率技术(micro-particle application)。 Tosoh公司跳过传统3m微粒尺寸限制发展了一种超快速反相填料——TSKgel Super-ODS，以2m硅颗粒为基质，可以获高速度和高分辨率
二、柱规格 表1 TSKgel Super-ODS柱规格
三、填料特性 表2 反相填料物理特性(引入十八烷基) 1) 用水银测孔计测量, 2) 用SEM测量 TSKgel Super-ODS孔体积和总表面积约是常见反相填料TSKgel ODS-80Ts的1/3，使得孔体积和总表面积减小后在高压下仍有足够的压降 TSKgel Super-ODS孔径比较大，通过C18聚乙烯层时可保证足够的保持力和选择性 填料的平均粒度为2.3m，约是常见填料粒度的一半，可实现高理论塔板数 微粒尺寸标准偏差小于常见产品标准偏差，相对低压力条件下获得高理论塔板数
四、色谱特性 4.1柱效 4.2空间排列选择性 4.3残留硅烷醇的干扰 4.4 熬形化合物的洗提 4.5流速与柱效的关系
柱子 粒度(m) 芴 分离度Rs (NAP/FLU) 压降*(kg/cm2) RT (min) TP/柱 TSKgel Super-ODS 2 3.71 10728 2.30 97 ODSA组 3 6.10 7453 2.38 98 ODSB组 3 4.70 8701 2.27 124 ODSC组 3 6.58 5893 2.39 116 ODS D组 3 6.61 7652 2.38 94 4.1 柱效 表3 5cm TSKgel Super-ODS和ODS的柱效比较 * 70% 甲醇, 1mL/min, NAP: 萘, FLU: 芴 常见3m填充柱理论塔板数约为每5cm 6000到8000，而TSKgel Super-ODS 填充柱的理论塔板数大于10,000 TSKgel Super-ODS填料工作压降不大于3m柱的工作压降，这说明其 械强度高
柱子 粒度(m) 萘 压降* (kg/cm2) RT (min) TP/柱 TSKgel Super-ODS 2 4.06 20612 191 ODS A组 3 4.46 10651 262 ODS B组 3 3.47 11685 191 表3 10cm TSKgel Super-ODS和ODS的柱效比较 * 70% 甲醇, 1mL/min, 同等条件下TSKgel Super-ODS的压降低，理论塔板数高，而且保留时间小， 这是因为其总表面积小。
柱子 ο-terphenyl triphenylene 分离因子 (OT/TR) 分离度Rs (OT/TR) k' TP k' TP TSKgel Super-ODS 2.19 9596 3.84 6059 1.98 13.53 TSKgel ODS-80Ts 6.65 14163 8.00 14571 1.27 5.53 4.2 空间排列选择性 表5 空间排列选择性比较 洗提液：80% 甲醇(TSKgel Super-ODS)，85% 甲醇(TSKgel ODS-80Ts) ；流速：1mL/min；检测器：UV (254nm) 同TSKgel ODS-80Ts相比，TSKgel Super-ODS的分离度和分离因子都大， 且容积因子k’小。这表明TSKgel Super-ODS 被引入到了聚乙烯层的十八烷 基中，具有高空间排列选择性。
4.3 残留硅烷醇的干扰 图2 Super-ODS和ODS-80Ts洗提碱性物质嘧啶的对照比较 使用硅胶基的缺点是残留硅烷醇与样品离子之间存在交互干扰。一般来说， 如果填料表面残留有硅烷醇，则会排斥酸性物质离子，吸附碱性物质，导致 正常色谱获得困难。 洗提碱性物质物质嘧啶的对照比较。可以看出任何填料都洗出了嘧啶，这 说明填料中都存在足够的假象。
4.4 熬形化合物的洗提 图3 TSKgel Super-ODS对8-喹啉的色谱图 样品分离中，螯合物与填料表面的金属物质（如铁离子、铜离子等）形成金属化合物，致使分离效果变差，大大扭曲色谱峰形。而且易氧化还原的物质可能溶解，将改变色谱峰，影响分离效果，导致分离再现性降低。 Super-ODS和ODS-80Ts采用经特殊工艺处理的高纯硅胶，防止金属混入硅胶或生产过程，防止金属与样品物质交互干扰。因此，它们在螯合物的色谱分离中不会与金属交互干扰，没有氧化物，具有很好的分离再现性。 由图3可以看出很明显洗提结果良好。
4.5 流速与柱效的关系 柱效用不同样品在柱子内的扩散分布来描述，见下式： H = Hp + Hd + Hs + Hm 式中：H为柱子的理论塔板高度， Hp为涡流扩散分布， Hd为流动相中的纵向扩散分布， Hs为固定相中质量传递迟滞分布， Hm为流动相中质量传递迟滞分布。 与粒度有关的是Hd和Hm，减小粒度将会引起Hm的大幅度增大，Hm与粒度成平方关系。 此外，尽管Hd、Hs和Hm都与流速有关，但是当提高流速时，Hd将会变小，而Hs和Hm则会增大，柱效一般在高流速时降低。然而，减小粒度会使Hm的影响力加大，抑制了高流速时柱效的下降。
图4 不同洗提液下Super-ODS 和ODS-80Ts中流速与柱效的关系 可以看出，甲醇洗提液中，TSKgel ODS-80Ts最佳流速范围在4cm/min线 速度附近（约0.6mL/min），而SKgel Super-ODS最佳流速范围在6cm/min 线速度附近（约1mL/min）。ODS-80Ts柱效在4cm/min处开始迅速变差，而 Super-ODS的柱效却是逐渐变差。
乙腈洗提液中，ODS-80Ts的最佳流速范围在6cm/min附近（1mL/min），乙腈洗提液中，ODS-80Ts的最佳流速范围在6cm/min附近（1mL/min）， 而SKgel Super-ODS的最佳流速范围在12cm/min附近（2mL/min），二者的 最佳流速范围都比在甲醇洗提液的高。这是因为不同溶剂粘度引起不同的 质量传递速度。使用低粘度溶剂进行样品分离时，流速引起的柱效恶化不 大，而通常使用高流速进行分析。 图5 洗提液中流速与压力的关系
五、影响分离效果的因素 尽管影响分离效果的因素与传统分析柱相类似，但是柱体积变小时却有多种因素开始影响柱效。影响柱效的因素大致分成如下三类： （1）空体积 （2）检测器响应 （3）进样量 空体积进一步分为柱外空体积偏差和柱内空体积偏差。柱内空体积偏差是柱结构需要解决的一大难题，TSKgel Super-ODS柱已经被有意设计成十分低的死体积。 柱外影响因素有连接管路，检测器体积。
5.1连接管路对柱效的影响 从表6可以明显看出，连接管体积超过2L 时柱效大约降低10%。同时也可看出，注射器和柱子之间空体积对柱效的影响大于柱子和检测器之间空体积对柱效的影响。
5.2检测器体积对柱效的影响 检测器使用了2L微流通池、10L标准流通池和低死体积流通池。与微流通池相比，低死体积流通池的柱效降低了6%，但是标准流通池的柱效却降低将近70%，这是因为散热片体积达到约30L ，说明使用TSKgel Super-ODS这样短的柱子时要求最小化池体积。
5.3检测器响应对柱效的影响 在快速分离时，检测器响应对柱效也有很大影响。表8可以明显看出，当时间常数变大时，分离度和理论塔板数急剧降低。因此，时间常数应当尽可能地小。图6给出不同时间常数时测得的色谱，可以清楚看出，时间常数在3 sec时，峰宽度变大，致使分离度明显下降。
5.4 进样量对柱效的影响 进样量与维持柱子性能所需注射量的限度有关，所需注射量又与洗提液和样品溶液的成分相联系。图7给出进样量与柱效的关系。将样品溶解在与其成分相似的溶液中，当进样时，在小进样量处TSKgel Super-ODS (5cm柱)的柱效开始降低，这是因为它的凝胶只是TSKgel ODS-80Ts的1/3，有效表面积也小。TSKgel Super-ODS柱推荐使用10L或更小进样量。然而，从图7可以看出，将样品溶液中有机溶剂的含量提高一倍，进样量可增加近一倍而不会降低柱效，即将甲醇的含量从70%减少到40%。 图7 进样量对柱效的影响
六、 应用 图8给出几个快速化学分离的应用。当流速 从1mL/min 提高到4mL/mi ，分析时间则从3分 钟缩短到1分钟，或者更短，这便实现了快速分 离。尽管分离度随流速逐渐降低，但是分析时 间却缩短到1/4。
图9 维生素D2和D3分离谱图的比较 从图可以看出，聚乙烯层ODS-80Ts 对维生素D2和D3没能有效分离，而聚乙烯层Super-ODS 却对维生素D2和D3实现了快速分离，并且分离效果良好。
图10 缩氨酸分离谱图 虽然TSKgel Octadecyl-NPR是一种聚合型疏水性反相填料（2.5m），对缩氨酸或蛋白质也可实现快速分离，但其缺点是对亲水性缩氨酸的保持力弱，这是由其填料亲水性弱所造成的。另一方面，由于TSKgel Super-ODS采用多孔渗水填料，具有足够的亲水性，能够对高亲水性缩氨酸实现有效分离。
八、 结 论 TSKgel Super-ODS 是一种采用微颗粒硅胶的快速、高分辨率反相填充柱，其填料是将C18引入到高强度、高纯度硅胶基上的聚乙烯涂层中，残留的硅烷醇团和金属团又不会严重影响分离效果。 为发挥TSKgel Super-ODS柱的最佳分离效果，建议使用死体积尽可能小的分离装置。柱外损耗是引起分离度下降的主要因素。
