Őssejtek (2)

1. Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetéseaz Európai Unió új társadalmi kihívásainaka Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

2. Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetéseaz Európai Unió új társadalmi kihívásainaka Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 Dr. Pongrácz Judit Háromdimenziós szövettenyésztés és „tissueengineering” – 3. Előadás Őssejtek (2)

3. Köldökzsinórvér-őssejtek (CBE) • Kb. 130 millió gyermek születik évente – a regeneratív gyógyászat számára a köldökzsinórvér jelenti a legnagyobb potenciális őssejt-forrást • Az elmúlt 36 évben több, mint 10000 beteget kezeltek köldökzsinórvér-őssejtekkel • Több, mint 80 különböző betegség kezelésére alkalmaztak köldökzsinórvér eredetű őssejteket

4. Köldökzsinórvér-őssejtek ésmagzati őssejtek Köldökzsinórvér gyűjtése (Születés után) 1 2 3 Köldökzsinórvér hozzáadása A vér vizsgálata Sejt szeparáció A köldökzsinórvér sejteket speciális zsákban vagy kapszulában fagyasztják le Sejtek koncentrálása Keverés és ülepítés Sejtek fagyasztása 35 perc 10 perc Folyékony nitrogén tartály (-150°)

5. Krioprezerváció (Mélyfagyasztás) A primersejtekkrioprezervációja hosszú távon lehetséges (akár 20 évig) Az alacsony hőmérsékletet (-150-196oC)folyékony nitrogén biztosítja

6. Köldökzsinórvér feldolgozása • Vörösvértestek eltávolítása (Ficoll, Hetastarch, Lymphoprep, Prepacyte) • A kisebb tárolási méret érdekében a plazma eltávolítása • A kinyert sejtek tesztelése (fertőzés, térfogat, cellularitás, őssejt-szám, CD34+)

7. Köldökzsinórvér feldolgozása és krioprezerváció • A köldökzsinórvér elsősorban hematológiai betegségek kezelésében hasznos • A köldökzsinórvért születéskor gyűjtik • Azonnal feldolgozzák vagy tisztítás nélkül DMSO hozzáadásával folyékony nitrogénben lefagyasztják

8. Köldökzsinórvér bank • Ideális esetben valamennyi nagyvárosban rendelkezésre áll, egy nemzetközi adatbázis-hálózathoz csatlakozik, ahol valamennyi tárolt sejt HLA-tipizálásának adatai hozzáférhetőek. • A köldökzsinórvér hosszú távú tárolása költséges

9. A köldökzsinórvér-őssejtek pluripotenciája Köldökzsinórvér Tisztítás Őssejtek CBE MSC Endodermális Mezodermális Ektodermális Hepatobiliáris Vér Neurális

10. Őssejtpopuláció a köldökzsinórvérben Adherens MSC Pre-MSC CBE Nem adherens Lin- CD133+ CD34+ Köldökzsinórvér Csontvelő Perifériás vér

11. Köldökzsinórvér-őssejtekkel gyógyítható betegségekI. Onkológiai betegségek Immundeficienciák Ataxia telangiektázia Porc-haj hipoplázia Krónikusgranulomatózus betegség DiGeorge szindróma Hipogammaglobulinémia IKK gamma deficiencia Autoimmun poliendokrin szindróma II-es típusú mukolipidózis Myelokathexis Súlyos kombinált immunhiányos betegség Wiscott-Aldrich szindróma X-hez kötöttagammaglobulinémia, immunhiány, limfoproliferatív szindróma • Akutlimfoidleukémia • Akut mieloidleukémia • Autoimmunlimfoproliferatív betegségek • Burkitt limfóma • Krónikus mieloidleukémia • Monoszómia okozta citopénia • Familiárishisztiocitózis • Hodgkin-kór • Juvenilis mielomonocitásleukémia • Langerhanssejtes hisztiocitózis • Mielodiszpláziás szindrómák • Non-Hodgkinlimfóma

12. Köldökzsinórvér-őssejtekkel gyógyítható betegségek II. Hematológiaibetegségek Anyagcsere betegségek Adrenoleukodisztrófia Alfamannozidózis I-es típusú diabétesz Gaucher-kór Gunther-kór Hermansky-Pudlak szindróma Hurler szindróma Hurler-Scheieszindróma Krabbe-kór Maroteau-lamy szindróma Metakromatikusleukodisztrófia II-es és III-as típusú mukolipidózis A és B típusú Neimann Pick szindróma Sandoffszindróma Sanfilipposzindróma Tay Sachs betegség • Autoimmunneutropénia • Ciklikusneutropénia • Diamond Blackfran anémia • Evanszindróma • Vörösvértest aplázia • Refrakter anémia • Súlyos aplasztikus anémia • Sarlósejtes anémia • Thalasszémia • Fanconi anémia • Glanzmann-kór • Kongenitális szideroblasztos anémia • Juvenilis dermatomiozitisz és xanthogranulomák, stb.

13. Zsírszövet-eredetű őssejtek (ASC) • Zsírszövet-eredetű őssejtek (ASC): • Könnyen izolálható • Állandó immunfenotípus jellemzi • A csontvelői őssejtekhez (BMSC) hasonló • Multipotens • Genetikailag módosítható

14. A zsírszövetek típusai

15. Zsírszöveti őssejtek izolálása Mosás PBS-ben 300g, 5 perc Zsírsejtek leszívása Emésztés kollagenázzal 37oC-on, 1 óra Stróma-vaszkuláris frakció (SVF)

16. A zsír eredetű őssejtek immunfenotípusaPozitív markerek

17. A zsír eredetű őssejtek immunfenotípusaNegatív markerek

18. A zsírszövet eredetű őssejtek citokinprofilja

19. A zsírszövet eredetű őssejtek immunogenitása • Az immunogenitás hiánya annak köszönhető, hogy a felszínükről hiányoznak a II-es típusú fő hisztokompatibilitási antigének (HLA-DR). • Immunszuppresszív tulajdonságuka prosztaglandin E2 termeléshez kapcsolódik.

20. A zsírszövet eredetű őssejtek differenciáciálódási potenciálja • Zsírsejt • Szívizomsejtek • Porcsejtek • Endodermálisés ektodermálissejtvonalak • Endotélés simaizom sejtek • Hemopoetikussejtek • Neuronálissejtvonal • Oszteoblasztok • Harántcsíkolt izomsejtek

21. Zsírsejtekké történő differenciáció

22. Szívizomsejtekké történő differenciáció

23. Porcsejtekké történő differenciáció

24. Oszteocitákká történő differenciáció

25. Harántcsíkolt izomsejtekké történő differentáció

26. Idegsejtekké történő diferenciáció

27. Differenciációendodermális és ektodermális sejtvonalakká

28. Endotél és simaizom sejtekké történő differenciáció

29. Hemopoetikus utánpótlás

30. Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetéseaz Európai Unió új társadalmi kihívásainaka Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 Dr. Pongrácz Judit Háromdimenziós szövettenyésztés és „tissueengineering” – 4. Előadás Őssejtek (3)

31. ESC-kés ASC-k felhasználása Embrionálisfejlődés Endoderma Ektoderma Blasztociszta Belső sejttömeg ESC Tüdő Agy Neuron Asztrocita Oligodendrocita NSCs Szubventrikuláris zónaniche Hippokampuszniche (gyrusdentalis ) PluripotensESC BASCs BADJ niche Endodermális őssejt Ektodermális őssejt Mezodermálisőssejt Tüdőbetegségek Agyi és gerincvelői rendellenességek Hemangioblaszt Szem • Hasnyálmirigy • Inzulin-termelő b-sejtek RSCs Csillós epitélniche Mesoderma Szív Szívizomsejtek Exockrin acinusok Cornea EndokrinLangerhans szigetek CESCs Limbus niche CSCs Pitvarniche Szívcsúcs niche Retina PSCs Hasnyálmirigy- vezeték feltételezett niche Szembetegségek Bőr Cukorbetegség Szívbetegségek Máj Májsejtek KSCs Alaprétegniche Csont EPC HSC MSC bESCs eNCSCs „Bulge” régió niche HSCs Endoszteumfelszín niche Hajszálér hálózat niche Oszteoblasztok Porcsejtek Zsírsejtek Mioblasztok Közös mieloid prekurzor Közös limfoid prekurzor HDCs Epevezeték (Hering csatorna) MSCs Perivaszkulárisfelszín niche SKPs Tüsző papilla NK-sejtek Vérlemezkék T-limfociták Eritrociták Májbetegségek Bőrbetegségek B-limfociták Granulociták Hemopoetikus ésImmun- rendszeri megbetegedések Dendritikus sejtek Monociták Makrofágok Génterápiák Véráram Neutrofil Érlumen NK-sejt Intravénás injekción Genetikailag módosított őssejtek HSC EPC Makrofág Vérlemezke Eozinofil T-limfocita Eritrocita Bazofil B-limfocita Monocita Új endotélsejt Dendritikus sejt Media Érfalban található őssejtek EPCsandMSCs Keringési betegségek Vaszkulogén zóna

32. Génsebészet és génátvitel ASC-k felhasználásával • ASC sejtek transzdukciója lentivirálisvektorokkal • Egyéb rekombinánsvirálisvektorok • Nukleofekció

33. Az őssejt-szaporodás és differenciáció irányítására alkalmazott módszerek Sejtvonal-specifikus génekkel történő transzdukció segítheti a differenciáció irányítását. Riporterek (pl.: GFP)alkalmazása megkönnyíti a sejtek szelekcióját (pl.: FACS) illetve a génaktiváció helyének és idejének ellenőrzését. A tenyésztőmédiumhoz adott különböző biokémiai faktorok (szérumot beleértve) stimulálják a differenciációt. Ehhez szükséges azon faktorok ismerete, amelyek valószínűleg elősegítik a differenciációt, ugyanakkor ritka a 100%-os hatékonyság. Gén Riporter (pl.GFP) A többféle méretben és típusban kapható bioreaktorok növelik a tápanyagok illetve bomlástermékek cseréjének hatékonyságát, elősegítik a növekedési faktorok transzportját, lehetővé téve a sejtkultúrák hosszú távú fenntartását, és így nagyobb sejtszám vagy nagyobb szövetméret elérését. Sejt-szortoló technikák alkalmazásával (MACS vagy FACS)a kívánt sejtek kiválogathatóak (vagy a nem kívánt sejtek eltávolíthatóak) sejtfelszíni antigéneket kötő antitestek felhasználásával vagy fluoreszcens markerek, például GFP expresszió alapján. FACS MACS A kívánt sejtekkel vagy szövetekkel (pl.: szövetregeneráció céljára) létrehozott ko-kultúrák a közvetlen fizikai kontaktus és/vagy közvetett biokémiai jelek útján elősegíthetik a differenciációt. Egyes specifikus sejttípusok szelekciója adhéziós assay-elspecifikus ECM fehérjék vagy receptor ligandokfelhasználásával a sejt-szubsztrát interakciók affinitása és kinetikája alapján. Ide tartozik a kolónia formálóegység (CFU) assay is. A „scaffold”-ok fizikai (pl.: felszíni érdesség, porozitás, stb.) és biokémiai (pl.: beágyazott növekedési faktorok szabályozott felszabadulása) sajátságai elősegítik a sejtek tapadását, toborzását, differenciálódását, illetve megkönnyíti a sejtek szállítását.

34. Újraprogramozás Vírusszállítja az újraprogramozáshoz szükséges faktorokat a szomatikus sejt magjába PluripotensiPSCsejtvonal Szomatikus sejt újraprogramozása Tenyésztés hESC-ként

35. Sejtek differenciálódása I. Prekurzor sejt Szabályozó fehérje1 Sejtosztódás Szabályozó fehérje 2 Szabályozó fehérje 2 Szabályozó fehérje 3 Szabályozó fehérje 3 Szabályozó fehérje 3 Szabályozó fehérje 3 Sejt C Sejt D Sejt G Sejt H Sejt A Sejt B Sejt E Sejt F

36. Sejtek differenciálódásaII. Ivarsejtek Spermium Petesejt Gasztrula Ektoderma (Külső réteg) Blasztociszta Zigóta Epidermisz bőrsejtjei Agy neuronjai Pigmentsejt Mezoderma (Középső réteg) Szívizom Harántcsíkolt izomsejtek Vörösvértestek Simaizom Vesetubulus sejtek Endoderma (Belső réteg) Tüdősejt (Alveroláris sejt) Pajzsmirigy sejt Hasnyálmirigy sejt

37. Érett, szervspecifikusprimer sejtek I. Sejtkultúra Biopszia Tisztítás TE-ben használható sejtek

38. Érett, szervspecifikusprimer sejtek II. Tisztítás TE-ben használható sejtek Szövetspecifikus rezidens őssejtek Biopszia Sejtkultúrák Differenciálódott szöveti sejtek

39. Az epidermisz differenciálódása Elszarusodó envelope Lipidenvelope Lipidek felszabadulása a lamellárisgranulumokból Filaggrin, loricin, trichohyalin, involucrin, SPRRs, S100 fehérjék Stratumcorneum Szemcsés réteg Keratin-2e Epidermálisdifferenciáció Stratumspinosum Keratin-1, -10 Alapréteg Keratin-5, -14 Alapmbrán

40. Érett szövetspecifikus sejtek „tissue engineering”-ben • Biopszia vagy reszekció • Tisztítás • A proliferációs képesség visszaállítása sejtkultúrában • Re-differenciáció

41. Szabályozási kérdésekI.Sejtek • GLP • GMP • Engedély embrionális őssejtekkel történő munkához

42. Szabályozási kérdésekII.Állatok • Engedély állatokkal végzett kísérletekhez • UK: Home Office Licence 1986 • EC 1394/2007

43. Szabályozási kérdések III.Humán embrionális őssejtek • A humán embriók őssejt-forrásként való felhasználása körüli etikai viták (etikai kérdések)

44. Regeneratívmedicina • Szervek regenerációja sajátregeneratív biokémiaiéscellulárisfolyamataik révén • Szervregeneráció in vitro létrehozottegészszervek vagy egy szerv specifikus szöveteinek hozzáadásával

45. Szervelégtelenség • Betegség, baleset vagy öregedés miatt fellépő szervműködési elégtelenség esetén a teljes szerv pótlására vagy regenerációjára van szükség • Ideális esetben a beteg számára a saját (autológ) szövetei szolgálnak „bioalapanyagként „e szervek létrehozásához