第十四章 唾液及唾液斑检验

1. 第十四章 唾液及唾液斑检验 余　舰

3. 唾液（saliva）由唾液腺所分泌的液体。人一昼夜分泌量约为1000～1500毫升。其中大唾液腺约分泌5/6，小唾液腺分泌占1/6。其去路乃自觉与不自觉的被咽入胃中，绝大部分被重吸收，以维持体液平衡。唾液分泌有一定节律，夜间静止，清晨较少，下午4～6时达高峰。唾液（saliva）由唾液腺所分泌的液体。人一昼夜分泌量约为1000～1500毫升。其中大唾液腺约分泌5/6，小唾液腺分泌占1/6。其去路乃自觉与不自觉的被咽入胃中，绝大部分被重吸收，以维持体液平衡。唾液分泌有一定节律，夜间静止，清晨较少，下午4～6时达高峰。 • 唾液成分中99.4％为水，其中固体物约0.6％，无机物0.2％，包括Na+、K+、Cl-、HCO-3等。有机物有粘蛋白、球蛋白、氨基酸、尿酸、尿素、肌酸酐和酶。

4. 下颌下腺及腮腺唾液的蛋白质含量为0.1～0.5克/100毫升。以粘液蛋白居多，其次为唾液淀粉酶和少量免疫蛋白（IgA）。酶有唾液淀粉酶、麦芽糖酶、ATP酶、5′-核苷酸酶、脂酶、激肽释放酶、碱性磷酸酶、氨基氧化酶等。唾液淀粉酶仅存在于人、类人猿、猪、兔、大鼠、小鼠、豚鼠的下颌下腺及腮腺唾液中，而狗、猫、牛、马、山羊及绵羊的唾液中则含量极少或不含此酶。下颌下腺唾液中含有与红细胞同样的血型凝集原A、B、O等物质，其浓度为10～20毫克/升。来自下颌下腺粘液细胞。下颌下腺及腮腺唾液的蛋白质含量为0.1～0.5克/100毫升。以粘液蛋白居多，其次为唾液淀粉酶和少量免疫蛋白（IgA）。酶有唾液淀粉酶、麦芽糖酶、ATP酶、5′-核苷酸酶、脂酶、激肽释放酶、碱性磷酸酶、氨基氧化酶等。唾液淀粉酶仅存在于人、类人猿、猪、兔、大鼠、小鼠、豚鼠的下颌下腺及腮腺唾液中，而狗、猫、牛、马、山羊及绵羊的唾液中则含量极少或不含此酶。下颌下腺唾液中含有与红细胞同样的血型凝集原A、B、O等物质，其浓度为10～20毫克/升。来自下颌下腺粘液细胞。

5. 唾液的功能为：湿润口腔，调和润湿食物，使食物溶解并引起味觉，便于吞咽；淀粉酶可水解淀粉及糖原，起到消化作用；在胃内此种淀粉酶仍可持续作用10～30分钟，直到pH降至4.5，在酶失活前，食物中约60～70％淀粉转变成麦芽糖、糊精、麦芽三糖等。唾液可防止口腔干燥，清除食物残渣，洁净口腔；其中溶酶体硫氰酸盐及蛋白质抗体可杀灭细菌。唾液可中和胃酸保护胃壁。唾液的功能为：湿润口腔，调和润湿食物，使食物溶解并引起味觉，便于吞咽；淀粉酶可水解淀粉及糖原，起到消化作用；在胃内此种淀粉酶仍可持续作用10～30分钟，直到pH降至4.5，在酶失活前，食物中约60～70％淀粉转变成麦芽糖、糊精、麦芽三糖等。唾液可防止口腔干燥，清除食物残渣，洁净口腔；其中溶酶体硫氰酸盐及蛋白质抗体可杀灭细菌。唾液可中和胃酸保护胃壁。

6. 唾液中含的氟化物可减少龋齿发生率，保护牙齿。唾液中含的ABO血型物质可测定血型。唾液中（已知成年雄性小鼠）含神经生长因子和表皮生长因子可有助于创面收缩，伤口愈合。唾液还有助于医学诊断。在某些缺乏汗腺的动物（如狗），唾液分泌还可调节体温及水的平衡。唾液中含的氟化物可减少龋齿发生率，保护牙齿。唾液中含的ABO血型物质可测定血型。唾液中（已知成年雄性小鼠）含神经生长因子和表皮生长因子可有助于创面收缩，伤口愈合。唾液还有助于医学诊断。在某些缺乏汗腺的动物（如狗），唾液分泌还可调节体温及水的平衡。

7. 第一节　概述 • 唾液斑(Saliva stain)是唾液干燥后形成的斑痕。唾液斑是法医物证检验中常见的生物检材之一。现场的烟蒂、手帕、口罩、纸巾、瓜子皮、果核、喝过水的茶杯、尸体皮肤及其他物品上的咬痕等均可遗留有唾液斑。

8. 一、唾液及唾液斑的特点 • 唾液是唾液腺的分泌物，唾液腺包括腮腺、颌下腺、舌下腺以及口腔粘膜的无数小唾液腺等。唾液中水分约占99.4 %,其余为固体物。腮腺分泌浆液，其他各腺分泌粘液。唾液中含有大量的有机物质，如粘蛋白及球蛋白、氨基酸、尿素、尿酸、大量的唾液淀粉酶及麦芽糖酶等，还有血型物质。无机物质有钠、钾、氯、钙、铵、磷酸盐、碳酸盐及硫氰酸盐等。唾液中还有口腔粘膜脱落上皮细胞、大量细菌及食物残渣等。

9. 正常纯净的唾液无色，无味，接近中性，pH6.6～7.1，低渗。正常成年人每日分泌唾液约1.0～1.5升，分泌量及性质受精神因素、刺激的强度和性质影响，与食物种类亦有一定关系。含粘蛋白多时，唾液呈粘液状，含粘蛋白少时则较稀薄。吸烟者唾液中硫氰酸化合物含量明显增多。龋齿患者，唾液中乳酸含量增加。唾液斑在白色背景上常呈淡黄色，在紫外线下发淡青色荧光。

10. 二、检验的目的与要求 • 唾液及唾液斑检验的主要目的是个人识别。唾液中含有的血型物质及口腔粘膜脱落上皮细胞中的DNA，在斑痕中能长期保存，少量唾液斑即可进行个人识别。亲子鉴定时亦可以采取被鉴定人的唾液，测定DNA多态性等。 • 唾液斑检验首先要求确定检材是否唾液斑，确证唾液斑后再作个人识别，判定斑痕的个体来源。由于含唾液斑的检材通常出现在人们日常生活用品或物品上，例如口杯、烟头、果核等，故确证唾液斑后，可直接进行个人识别，不必进行种属鉴定。但在鉴定咬痕的唾液斑时，首先要确定是人咬痕还是动物咬痕。

11. 三、唾液及唾液斑的提取 • 采取新鲜唾液样本时，应要求被鉴定人先漱口，再将纱布或棉拭子放人口中，浸湿后取出，立即置通风干燥处晾干，分别包装，作好有关的记录。也可将自然流出的唾液，置干净容器内，立即放水浴中煮沸10min，灭活唾液中的血型分解酶活性，然后置冰箱保存。

12. 唾液斑是常见的法医物证检材，勘验现场时，必须注意寻找、收集唾液斑。烟蒂、瓜子壳、果核、口罩、手帕等检材，注意用镊子夹取。茶杯、易拉罐、酒瓶等应戴手套提取，不可直接用手触摸，以防检材被取材人的汗液污染。因为分泌型汗中含有的ABH物质会影响 ABO血型测定结果；而皮肤脱落细胞的DNA可干扰唾液斑DNA分型结果。现场发现可疑痰迹、尸体皮肤及其他物体上咬痕部位的可疑唾液斑，应用少量生理盐水浸湿的纱布擦取，晾干后备检。

13. 第二节　唾液斑的证明 • 唾液中含有大量的淀粉酶，要分析检材是否唾液(斑)时，可检查淀粉酶。但人体粪便、几乎所有的植物、发芽种子和真菌中均含淀粉酶，人体其他分泌液如鼻涕、尿、精液等也含少量淀粉酶，因此单测出斑痕中含有淀粉酶，不能确证唾液(斑)。如果在检材中同时检出口腔粘膜脱落上皮细胞，可确证唾液斑。

14. 一、淀粉酶的检测 • 淀粉-碘试验是检查唾液斑中淀粉酶常用的方法。唾液中的淀粉酶较稳定，自然干燥、保存几个月的唾液斑仍可测出。 • 1．原理　淀粉遇碘呈蓝色。唾液中含有大量淀粉酶，能将淀粉分解为糖，糖与碘不呈蓝色反应。因此，将已知淀粉溶液与唾液斑作用后，再加碘，若不显蓝色，说明反应体系中淀粉已被唾液淀粉酶分解。然后再利用糖的还原作用验证淀粉分解产物糖的存在，便可判断检材中含有淀粉酶。

15. 2．方法　首先证明斑痕中是否含有淀粉酶。取斑痕约0.2cm2，同时取无斑痕检材作对照，分置于试管内。加0.01%淀粉溶液0.1ml，将试管放入37℃温箱中60min，加碘液l滴，观察颜色变化。对照管立即出现蓝色，检材管无色或呈淡黄色，为阳性反应，证明检材中含有淀粉酶，可疑斑痕可能为唾液斑。若检材管出现蓝色，则为阴性，证明检材不含淀粉酶或酶已失活，不能证明检材是唾液斑。2．方法　首先证明斑痕中是否含有淀粉酶。取斑痕约0.2cm2，同时取无斑痕检材作对照，分置于试管内。加0.01%淀粉溶液0.1ml，将试管放入37℃温箱中60min，加碘液l滴，观察颜色变化。对照管立即出现蓝色，检材管无色或呈淡黄色，为阳性反应，证明检材中含有淀粉酶，可疑斑痕可能为唾液斑。若检材管出现蓝色，则为阴性，证明检材不含淀粉酶或酶已失活，不能证明检材是唾液斑。

16. 淀粉-碘反应阳性者可进一步证明糖的存在。取上述检材淀粉液2滴置于试管中，加碱性铜溶液2滴，在火焰上短时加热至液体出现气泡时止。出现红至棕红色沉淀为阳性反应，不出现沉淀为阴性反应。也可在检材淀粉液中加1 %氯化三苯基四氮唑液2滴，短时加热，出现红色沉淀为阳性反应，无色透明或浅红色为阴性反应。

17. 本试验灵敏度较高，5年以上的唾液斑，或唾液斑经100℃加热20min或200～300℃加热15min，均呈阳性反应。检测烟头唾液斑的淀粉酶时，要注意烟草浸出液所出现的假阳性。陈旧检材，酶的活性减弱甚至消失，可出现假阴性结果。本试验灵敏度较高，5年以上的唾液斑，或唾液斑经100℃加热20min或200～300℃加热15min，均呈阳性反应。检测烟头唾液斑的淀粉酶时，要注意烟草浸出液所出现的假阳性。陈旧检材，酶的活性减弱甚至消失，可出现假阴性结果。

18. 二、口腔粘膜脱落上皮细胞的检查 • 唾液中含有口腔粘膜脱落上皮细胞，将检材用生理盐水充分浸泡，弃去载体，离心，取沉淀物涂片，干燥后HE染色，显微镜下检查。如发现口腔粘膜脱落上皮细胞，结合淀粉酶试验阳性结果，可判断为唾液斑，如同时查见食物残渣，则更支持此结论。

19. 三、其他方法 • 唾液斑证明亦可采用抗腮腺素血清，与斑痕浸液作沉淀试验；或对检材中的微量元素作综合分析，确证唾液斑。

20. 第三节　唾液斑的个人识别 • 目前主要用DNA分析法。 • 一、唾液(斑)的血型测定 • (一)中和试验测定ABO血型 • 唾液属人体分泌液，和精液一样含有水溶性A、B、H血型物质。分泌型人含量很大，非分泌型人也含有少量，可用中和试验检测，测定原理及方法同精斑ABO血型测定。

21. (二)酶标抗体免疫测定法检测ABO血型 • 酶标抗体免疫测定法灵敏度极高，适用于测定非分泌型唾液中的ABH物质。如用该方法测定分泌型唾液，需将唾液样本适当稀释，以免背景着色过深，影响结果判断。因此，对未知检材，最好先用中和试验分型，结果阴性时，才用酶标抗体免疫测定法。 • 唾液斑的ABO血型测定常用直接斑点ELISA法、间接斑点ELISA法及斑点ELISA双抗夹心法等，也可采用ELISA-ABC法。

22. 二、唾液多态性蛋白和酶测定 • 人类唾液中含有许多具有遗传多态性的酶和蛋白质。多态性蛋白主要有腮腺酸性蛋白、腮腺碱性蛋白等。 • 多态性酶主要有唾液淀粉酶、唾液酯酶、唾液葡糖6一磷酸盐脱氢酶、唾液酸性磷酸酶，以及唾液过氧化物酶等。 • 检测唾液中多态性蛋白与酶可用酸性尿素淀粉凝胶电泳、碱性聚丙烯酰胺凝胶电泳以及等电聚焦等方法。

23. 三、唾液(斑)的DNA分析 • 唾液中含有口腔粘膜脱落上皮细胞，可从中提取DNA，进行基因组DNA与线粒体 DNA多态性分析。唾液检材可以是新鲜唾液、用无菌生理盐水漱口的漱口水、唾液拭子及烟头等。由唾液和漱口水提取的DNA量相对较大，由烟头、唾液斑及唾液拭子提取的 DNA量较少。据报道，每15ml唾液及漱口水、每5cm2的唾液拭子与唾液斑DNA平均含量分别为12μg、22μg、1.3μg及0.8μg。测定10个烟头，每个烟头DNA的平均含量是12～120ng。

24. 提取唾液斑DNA，因检材加入量不易量化，故应结合检材具体情况调整。如烟蒂中能否提取出DNA与烟蒂是否沾有口腔粘膜脱落上皮细胞有关，也与抽烟者抽烟时口含烟蒂多少的习惯有关，故必须用沾有唾液或口唇上皮细胞的那部分检材，不能将整个烟蒂全部投入，否则过大的载体会影响DNA的提取。一般剪取0.3～0.5cm的过滤咀烟蒂，取外层纸剪碎放人1.5ml离心管中。用口腔拭子进行PCR分型时，取单根拭子头部的1／3～1／4装入1.5ml离心管中或用牙签刮拭口腔粘膜即可。而用纱布擦拭咬痕部位的唾液斑检材，剪取0.1～O.2cm2即可。提取唾液斑DNA，因检材加入量不易量化，故应结合检材具体情况调整。如烟蒂中能否提取出DNA与烟蒂是否沾有口腔粘膜脱落上皮细胞有关，也与抽烟者抽烟时口含烟蒂多少的习惯有关，故必须用沾有唾液或口唇上皮细胞的那部分检材，不能将整个烟蒂全部投入，否则过大的载体会影响DNA的提取。一般剪取0.3～0.5cm的过滤咀烟蒂，取外层纸剪碎放人1.5ml离心管中。用口腔拭子进行PCR分型时，取单根拭子头部的1／3～1／4装入1.5ml离心管中或用牙签刮拭口腔粘膜即可。而用纱布擦拭咬痕部位的唾液斑检材，剪取0.1～O.2cm2即可。

25. 分析血痕、精斑DNA多态性的方法，均能应用于唾液。好的唾液斑检材，只要能提出大分子DNA，可进行DNA指纹图分析；陈旧唾液斑，DNA部分降解，可用PCR法分析。所以分析DNA多态性是目前进行唾液(斑)个人识别的有效手段。分析血痕、精斑DNA多态性的方法，均能应用于唾液。好的唾液斑检材，只要能提出大分子DNA，可进行DNA指纹图分析；陈旧唾液斑，DNA部分降解，可用PCR法分析。所以分析DNA多态性是目前进行唾液(斑)个人识别的有效手段。

26. 四、唾液(斑)的性别鉴定 • 唾液斑的性别鉴定可检查口腔粘膜脱落上皮细胞中的X、Y染色质，也可通过DNA分析进行。由于前者灵敏度及准确性都欠理想，目前已被后者所替代。分析Y染色体或X染色体特异性DNA片段，是20世纪90年代后检测性别的主要方法。DNA分析方法包括Y特异性分子杂交技术及PCR技术。Y特异性分子杂交技术是将男性特有的Y染色体DNA片段作为探针，利用分子杂交技术检测性别。该法虽特异性高，但费时耗力，对DNA的含量及其完整性要求较高，且存在放射性物质的污染。PCR技术不仅特异性好、灵敏度高，且避免了分子杂交技术的缺陷，是目前唾液斑性别鉴定的主要技术。

27. PCR技术鉴定性别可检验性染色体特异性片段，如DY1序列、DY3序列、DXS454基因座的序列，或扩增X-Y同源Amelogenin基因、ZFY／ZFX基因。扩增Y-STR或X-STR基因座也能鉴定性别，且将性别鉴定与多态分析结合进行，节约了检材与试剂，提高了办案效率。PCR技术鉴定性别可检验性染色体特异性片段，如DY1序列、DY3序列、DXS454基因座的序列，或扩增X-Y同源Amelogenin基因、ZFY／ZFX基因。扩增Y-STR或X-STR基因座也能鉴定性别，且将性别鉴定与多态分析结合进行，节约了检材与试剂，提高了办案效率。