南京农业大学 陈溥言

1. 圆环病毒病 南京农业大学 陈溥言

2. 断奶仔猪多系统消耗综合症 （一） 概况 断奶仔猪多系统消耗综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)是一种新的猪传染病,主要侵害6-8周龄仔猪，引起淋巴系统疾病、渐进性体重下降、呼吸道症状及黄疸，造成患猪免疫机能下降、生产性能降低，给养猪业带来了很大的经济损失。该病1991年首次报道于加拿大，而后美国、法国、西班牙、意大利及墨西哥等美洲和欧洲国家相继报道此病的发生。我国中监所郎洪武等证实国内存在此病。最近研究表明PMWS的发生与一种猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）的感染有关。

3. （二 ）多病原疾病 PCV-2是PMWS的主要病因，但并不是唯一的病原。PMWS很可能是PCV和PPV、PRRSV等病原混合感染的结果。Alian等（1999）、Kennedy等（2000）、Krakowka等（2000）利用PPV和PCV-2共同感染未经母乳哺育的仔猪或悉生仔猪，成功复制出典型的PMWS症状及病变，但单独使用PCV-2实验感染，只能产生轻微的症状。同时也有学者将PMWS病死猪组织悬液感染仔猪，仔猪出现典型PMWS症状，而且可从病变组织中分享出PCV-2和PPV，血清中可检测到两者的抗体。因此可以认为PPV在PMWS疾病发生中起着重要作用，或者说PMWS就是两者共同感染的结果。 另外，PRRSV可以从一些已感染或正在感染PMWS的猪体内分离到。因此，有人认为PMWS是多病原疾病，可能是PCV与PRRSV、PPV等多种病原混合感染的结果。

4. （三）PCV致病性及危害 1、PCV可在猪源细胞培养物上繁殖，不产生CPE，易被忽视，因此对猪源细胞疫苗或诊断抗原生产造成潜在的危害。 2、PCV-2多数情况下引起亚临床感染，但如与其他病原如PPV等混合感染或环境应激情况下则可直接发生PMWS。 3、PCV-2的靶细胞 为淋巴细胞，主要是巨噬细胞、B细胞，病毒感染后引起细胞凋亡，使机体免疫抵抗力下降，从而继发感染其他病原体，包括PRRSV、PPV、PRV和猪链球菌等，引起更严重的疾病。

5. （四）该病主要表现： • 侵害：淋巴系统、呼吸道、黄疸 • 日龄：6-8周龄仔猪 • 影响：免疫机能下降、生产性能降低、 渐进性体重下降

6. （五）病原体 猪圆环病毒 2型（PCV-2）

7. 圆环病毒有两种血清型:PCV-1和PCV-2 • PCV-1基因组全长1759bp；PCV-2为1768bp。两者的基因组核苷酸序序列同源性仅为68~75%。 • PCV-1、PCV-2都主要包含ORF1、ORF2两个阅读框。ORF1编码与病毒复制相关的Rep蛋白，ORF编码病毒的核衣壳蛋白，具有良好的免疫原性。 • PCV-1无致病性，广泛存在猪源细胞及正常猪体内各组织；PCV-2现证明与断奶仔猪多系统消耗综合症（PMWS）、猪皮炎肾病综合症（PDNS）及A2型先天性综合征相关。

8. PCV-2基因组及编码蛋白示意图

9. PCV-1与PCV-2 • PCV-1：最初是从猪肾传代细胞系PK-15分离到，动物感染试验表明此PCV无致病性。该病毒可长期持续污染PK-15，不产生细胞病变 。 • PCV-2：PCV-2是PMWS的主要病因（但不是唯一的病原）。

10. 二、PCV-2毒株的分离鉴定 • 病料处理（将PCR扩增阳性的组织病料用氯仿抽提去除有曩膜的病毒，如PRRSV） • 接种细胞—PK-15盲传10代（300mmol/L的D-氨基葡萄糖处理） • 间接免疫荧光实验及电镜观察病毒颗粒

11. 接种病料的PK-15的IIF结果 未接种病料的PK-15的IIF结果

12. 病毒粒子电镜照片 本实验室共分离了5株PCV-2，根据其分离地将其分别命名为shanghai PCV、jiangsu PCV、dengta PCV、qingdao PCV及xiaosan PCV。 （卢银华） 超薄切片观察结果（30，000Х ）

13. 三 复合PCR方法的建立 1、引物设计 引物1（为PCV-1、2共同序列）： 5’-CCGCGGTGGCTGAACTT-3’（PCV-1 nt478-496；PCV-2 nt491-519）； 引物2（PCV-1特异序列）： 5’-CTCGGCTATGCGCTCCAAAATG-3’（PCV-1 nt1108-1129）； 引物3（PCV-2特异序列）： 5’-ACCCCCGCCACGTACC-3’（PCV-2 nt1627-1644） 引物1、2扩增的片段长度为652bp（ PCV-1 ），引物1、3之间的跨幅为1154bp（PCV-2）。

14. 2000bp 500bp 2、复合PCR方法的初步用 1）对多株猪源传代细胞（包括4株PK-15及1株ST细胞）进行了PCV检测，发现所有细胞均污染有PCV-1，其中一株还扩增出了PCV-2基因片段； 1 2 3 4 5 M M：DNA分子量标准 DL-2000 1：PK-15（a） 2：PK-15（b） 3：PK-15(c) 4：PK-15(d) 5：ST 1000bp 750bp

15. 1 2 3 4 5 6 7 8 M 9 1011 12 13 14 15 16 M 2)对38个病例(病猪表现为消瘦、呼吸困难及淋巴结肿大等)的组织（取肺组织）进行PCR扩增。结果发现，9个病例同时存在PCV两种血清型病毒感染，23个病例感染有PCV-2。部分电泳结果见下图。 图中样品1，3-8，10，11，13，15，16均为PCV-2阳性。2，9，14样品PCV-1、PCV2均为阳性。12为PCV-1阳性。

16. Table 1. 1 The PCR results of tissue samples Origin of tissue Number of tissue Number of positive tissue samples Positive rate of tissue samples(%) samples (case) samples 、 、 PCV2+ PCV1+ PCV1 2+ PCV2+ PCV1+ PCV1 2+ 11 3 2 2 27.3 18.1 18.1 上海 20 3 1 4 15 5 20 江苏 26 6 0 2 23.1 0 7.7 山东 43 0 0 0 0 0 0 福建 27 13 3 5 48.1 11.1 19.2 浙江 127 25 6 13 19.6 4.7 10 总计 3）病料检测结果 上海、江苏、山东及浙江四个省市猪群中普遍存在PCV感染，其中PCV2感染最为普遍，感染率分别达27.3%、15%、23.1%和48.1%。另外也存在一定程度的PCV1和PCV2的混合感染，感染率分别为18.1%、20%、7.7%及19.2%。

17. 四 分离PCV毒株全基因组序列分析 • 测序结果表明，5个PCV2分离株基因组全长均为1768bp，与以往资料报道的完全一致。 • DNAstar软件分析显示，本实验的5个毒株内部同源性为95.5%~100%，其中ShanghaiPCV及Zhejiang1PCV基因组序列完全相同，而JiangsuPCV与ShandongPCV、Zhejiang2PCV两毒株差异相对较大，同源性仅为95.5%。 • 所选用的2株PCV-1毒株AF012107、AF071879之间同源性很高，但它们与PCV-2毒株的同源性仅为 76.5-78.3%

18. 4、PCV毒株的系统发生进化树 • ShanghaiPCV、Zhejiang1PCV及JiangsuPCV与美国分离株AF264039亲缘关系很近。 • ShandongPCV、Zhejiang2PCV与德国分离株AF201311亲缘关系密切。由此说明，我国的PCV2分离株来源广泛。

19. percentldentity PCV毒株全基因组的同源性比较

20. 结 论 • 国内不同PCV2毒株基因组序列存在明显差异，从而为我国建立更有针对性的分子生物学诊断检测方法提供了依据。 • 华东地区PCV2分离株来源较为广泛。 • ORF2核苷酸序列变异显著。随着PCV2 ORF2的不断变异可能会出现新的PCV致病型和血清型。 • PCV2 ORF2编码蛋白存在2个特异的抗原区域，这为建立PCV2特异的检测方法提供了理论依据。

21. PCV的体外培养 PCV体外培养特性与猪细小病毒（PPV）相似，适于在具有旺盛增殖能力并处于有丝分裂过程中的细胞上复制，并且PCV的复制依赖细胞周期S期表达的细胞蛋白。Tischer等对猪肾传代细胞系PK-15 PCV培养物用a-氨基葡萄糖处理后可以促进病毒DNA进入细胞核，从而提高病毒复制，试验证明可使PCV抗原阳性的细胞数增加30%。Alian等证明PCV在源于猪骨髓、外周血液、肺洗出物和淋巴结的单核细胞/巨噬细胞中复制。牛外周血液来源的单核细胞也对PCV感染敏感。另有报道，PCV也可在猪睾丸传代细胞系（ST）及vero 细胞上生长。但遗憾的是，迄今为止，PCV在所有细胞上培养时均不产生细胞病变，病毒检测需借助于免疫荧光试验、免疫组化试验、核酸探针及PCR等方法，比较麻烦。

22. PCV流行病学 PMWS主要侵害6-8周龄的仔猪，一般4-10%的猪发病，这些病猪散在于正常的健康猪中，病死率高达50-100%。成年猪一般为隐性感染，不表现任何症状和病变。此病的一个主要特点是仔猪淋巴系统受损，出现免疫缺隐，因此常常继发感染一些别的疾病，如地方性猪肺疫、多杀性巴氏杆菌及链球菌感染，从而使疾病症状复杂化，难以确定疾病的真正病原。另一特点是发展缓慢，猪群的一次发病可持续12-18月之久，所以猪场所受的经济损失是很明显的。

23. PCV感染普遍 血清学调查表明,北美和欧洲的猪群中PCV抗体非常普遍,且抗体主要是针对PCV-2.如在德国屠宰场面猪血清中,85%有PCV抗体；在美国进行的一次调查中53%的样品有抗体；在英国随机采集的猪血清样品中86%有PCV抗体；在德国的一次调查中，用ELISA检测发现几乎所有猪群都感染PCV。但令人费解的是，PCV感染如此普遍，厕真正导致PMWS或其他不关疾病的不多，大多为隐性感染或亚临床感染。这部分原因可能是因为仔猪需感染一定数量的PCV-2才能出现临床症状及病变。

24. 环境因素十分重要 现已清楚，PMWS病猪可通过粪便和鼻分泌物排出PCV，引起病毒在不同猪个体之间进行传播。这种病毒在不同猪群之间的传播方式则尚不为所知；猪在不同猪群之间的移动很可能是主要的传播途径。由于这一病毒结构简单，非常能耐受不良环境，所以也可能通过衣服和设备进行传播。鸟类、啮齿动物如鼠等带毒，可能会引起传播。有试验表明，外观正常的公猪精液中可检测到PCV，因此可能存在PMWS病的垂直传播。混群、应激、高密度饲养等因素可诱发仔猪发病。

25. 临床症状和病理变化 该病的主要症状为进行性消瘦、呼吸困难、皮肤苍白或黄疸、共济失调及突然死亡。剖检后可见，病猪主要发年淋巴结病、间质性肺炎，其它大部分组织也存在病变，包括肝、肾、胰、皮肤和大脑。淋巴结（包括腹股沟、气管支气管及肠系膜等处）明显肿大，严重时体积可为正常的3倍，纵切面呈均匀白色；肺脏无塌陷，呈橡皮样水肿；其他组织都有不同程度的炎症。 显微病变，肺部明显多灶性闭塞性支气管肺炎，肺细胞增生明显，肺泡内含有中性白细胞、嗜酸性细胞、巨噬细胞及纤维性环死碎屑；在集合淋巴结、扁桃体及脾脏等组织淋巴滤泡坏死，淋巴细胞减少及巨噬细胞、多核巨细胞浸润，细胞内有多个球形嗜碱性或两染性胞浆内包涵体，电镜观察可见到包涵体由许多直径约为20nm的电子致密颗粒组成，呈晶格状排列。肠道病变主要是单核细胞浸润和小肠固有层形成合胞体。

26. 发病机理 PMWS的发病机理至今尚不清楚。Rosell等从2个慢性病例的病变发现，PCV－2从猪的鼻、口、侵入体内，在扁桃体、局部淋巴结增殖后，向其它淋巴组织、肺、肝、肾扩散。受慢性感染的影响，诱发免疫抑制、肠炎、间质性肾炎及肝损伤。 Shibahara等研究表明PCV感染可诱导B细胞凋亡，从而导致机体免疫功能下降。从这些结果可以看出PCV感染可能干扰正常的免疫功能，从而致使机体抵抗力下降，导致继发感染产生PMWS。 Krakowka等将PCV－2感染悉生仔猪后，注射弗氏不完全佐剂乳化的钥孔戚血蓝蛋白，可使PCV感染仔猪出现明显的PMWS症　及病变，而未钥孔戚血蓝蛋白注射的对照组不发生PMWS。 因此，目前认为免疫刺激在PMWS的发病过程中起着关键的作用。综上所述，PMWS的发生原因比较复杂，不仅与感染PCV－2有直接关系，而且可能与其它病原如PPV、PRRSV及猪链球菌等的感染或免疫应激密切相关。

27. 防 制 此病没有特异性的控制措施，也无有效的治疗方法。目前无理想的疫苗（主要是病毒滴度低），加上此病程持久对仔猪造成免疫缺陷。因此，要采取对症治疗。 抗生注射和良好的管理，有助于解决继发感染或并发感染的问题，但对此病本身无效。本病的疫苗正处于试验阶段。所以目前要控制此病只能依靠加强日常管理，目标是减轻疾病的压力以及此病的重要诱发因素。

28. 1降低饲养密度； 2实行严格的全进全出制； 3在每一批猪饲养期间以及在各批猪之间都要实验严格的生安全措施。在这些措施中应包括应用有效的消毒剂，现在英国有一种专利消毒剂Virkon在1：250稀释度时能有效杀灭圆环病毒。 4不要将不同来源的猪混群，也不要将不同年龄阶段的猪饲养在同一空间中 5 减少天气应激因子(如温度变化、贼风和有害气体) 6 有效控制鼠类及鸟类等带毒动物 7采用适当的手段(免疫接种、抗 生素治疗和加强管理)控制并发感染； 8 要尽可能保证猪群具有稳定的免疫状态，重要的是要搞好新猪群的隔离和混群