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PCR 引物设计及软件使用技巧

Sense primer. →. 3’. ←. 5’. Antisense primer. PCR 引物设计及软件使用技巧. 王深浩. 引物设计是 PCR 技术中至关重要的一环. 使用不合适的 PCR 引物容易导致实验失败：. a. 非特异性扩增 b. 扩增产物量较少 c. 无扩增产物. 2. 引物设计的原则. 1. 引物与模板的序列要紧密互补. 2. 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构. 3. 引物不能在模板的非目的位点引发 DNA 聚合反应 ( 即错配 ). 引物设计时考虑的因素. 引物长度 碱基分布的均衡性 Tm 值

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PCR 引物设计及软件使用技巧

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Presentation Transcript

  1. Sense primer → 3’ ← 5’ Antisense primer PCR引物设计及软件使用技巧 王深浩

  2. 引物设计是PCR技术中至关重要的一环 使用不合适的PCR引物容易导致实验失败： a. 非特异性扩增 b. 扩增产物量较少 c. 无扩增产物

  3. 2.引物设计的原则 1.引物与模板的序列要紧密互补 2.引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 3.引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)

  4. 引物设计时考虑的因素 引物长度 碱基分布的均衡性 Tm值 引物二级结构 引物3’端 引物5’端 引物的内部稳定性 引物的保守性与特异性

  5. 1. 引物长度引物的长度一般为15-30 bp 常用的是18-27bp，太短则特异性降低容易引起错配，太长则结合能量过高，不易结合。 2. 引物GC含量在40%~60%间，上下游引物GC含量 差异不要太大

  6. 3. 引物的3’端 a.引物3’端的末位使用碱基A 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基 b.引物3’端不要出现3个以上的连续相同碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加 c.引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。

  7. 4.引物5’端 • 引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基，在5’端引入一段非模板依赖性序列，如增加酶切位点等 5. PCR反应的Tm值（退火温度）.一般在55～70℃ 之间。 （这个温度不同软件的计算差异很大，有时需要实验人员摸索条件）

  8. 6.引物中尽量避免发夹结构和引物二聚体的出现。6.引物中尽量避免发夹结构和引物二聚体的出现。 Hairpin Dimer

  9. primer1 primer1 目的区域 primer2 primer2 7. 防止引物错误引发（False priming）

  10. Primer Premier 5.0的特点 • 人工操作，精度高 • 对于复杂结构引物设计可以结合试验条件 • 对引物做出取舍 • 总能设计出引物 • 效率低，不适合大规模设计引物

  11. Primer Premier 3.0（on line）的特点 • 操作简单，方便 • 无需考虑太多的因素 • 设计的引物可信度较高 • 不能对于复杂结构引物设计可以结合试验条件对引物做出取舍

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