A switch-1 hurok konformációjának és orientációjának vizsgálata FRET módszerrel

1. A switch-1 hurok konformációjának és orientációjának vizsgálata FRET módszerrel Végner László, Málnási-Csizmadia András Eötvös Loránd Tudományegyetem, Biológiai Intézet, Biokémiai Tanszék • Bevezetés • A miozin II motorfehérje az ATP hasításából származó energiát mozgási energiává alakítja az aktin filamentum mentén haladva. • A mozgás során ciklikusan változik a fehérje affinitása az aktin sínhez. • Az ATP kötése és hidrolízise, atermékeleresztés lokális, felerősödően továbbadódó konformációváltozásokat indukál. • Célkitűzések • Rekombináns miozin II motordomén termeltetése, preparálása és tisztítása. • A fehérjefragment aktívitásának ellenőrzése, a switch-1 fluoreszcens szenzorának (W239) tesztelése különböző nukleotid, és nukleotid analóg kötött állapotokban. • Fluoreszcens nukleotid analóg kötött állapotban a W239 és a nukleotid közötti távolság mérése, ezáltal a switch-1 konformációjának meghatározása. • A switch-1 nukleotidhoz viszonyított orientációjának meghatározása. • A switch-1 konformációinak és orientációinak vizsgálata aktin jelenlétében. 1. ábra • Módszer • A kísérleteket rekombináns D. discoideum miozin II motordoménen végeztük. • Az intakt motordomén működőképes, rendelkezik az ATP-kötő és az aktinkötő hellyel. • A rekombináns fehérje fragmens egy triptofán aminosavmaradékot tartalmaz a switch-1 hurokban (F239W). • A triptofán fluoreszcens szenzor, érzékeny a lokális térszerkezeti változásokra. • A vizsgálatokhoz nukleotid analógokat használtunk (ADPBeFx, mantdADPBeFx, ADPAlF4), ezek a bekötött ATP-t imitálják. • Fluoreszcens Rezonancia Energia Transzfer (FRET) • Az energia transzfer a gerjesztett triptofán szenzor (donor) és a mantdADPBeFx fluoreszcens nukleotid analóg (akceptor) között történik. • A transzfer alapja dipól-dipól kölcsönhatás. • Hatékonysága erősen függ a donor-akceptor távolságtól, ezért ideális távolságmérésre a két pont között. • A módszer közvetlen szerkezeti információkat nyújt a molekulán belüli távolságmérésen keresztül. • A FRET módszer kristályszerkezeti információk felhasználásával és in silico számítások mellett alkalmas a switch-1 térbeli orientációjának vizsgálatára. • Lehetőséget nyújt aktin jelenlétében is a konformációs állapotok detektálására, mivel az aktinban lévő triptofánok nem befolyásolják az energia transzfert. • Az ATP-kötő hely körül 3 hurok szenzorként működik (switch-1, switch-2, P-hurok). • Az ATP-vel és a hasított termékekkel kölcsönhatva ezek konformáció-változása közvetítődik az aktinkötőhely és a kilengést biztosító emelőkar felé. • A switch-1 elsősorban a nukleotidkötő hely és az aktinkötő hely közötti kommunikációért felel. D. Discoideum miozin II motordomén PDB kód: 1lvk 2. ábra • ATP kötése mellett a switch-1 konformációs egyensúlya a zárt állapot felé tolódik. Ennek hatására az aktinkötő hely kinyilik és az aktin disszociál. • ADP kötött állapotban, erős kölcsönhatásban az F-aktinnal a switch-1 nyitott állapota dominál. 3. ábra 4. ábra Transzfer hatékonyság (E): a gerjesztés során a donor által abszorbeált fotonok azon hányada, amelyek energiája az energia transzferben átadódik az akceptor felé Förster távolság (R0): az a távolság a donor és az akceptor között, ahol a transzfer hatékonyság 50%-os Donor-akceptor távolság (r): a W239 aminosavmaradék indol gyűrűje (donor) és a mantdADPBeFx nukleotid analóg mant gyűrűje (akceptor) közötti távolság Donor fluoreszcencia intenzitás akceptor hiányában (az aktív helyen ADPBeFx) ésbekötött akceptor mellett (mantdADPBeFx)(FD, FDA, ID) Orientációs faktor (κ2): a donor és az akceptor tranzíciós dipóljainak egymáshoz képest vett térbeli helyzetét jellemzi Refrakciós index (n): azt a közeget jellemzi, amelyben a mérendő minta van; értéke biomolekulákra vizes oldatban 1.4 Donor kvantum hatásfok (QD): a donor által emittált és abszorbeált fotonok aránya egy ismert referencia fluorofórhoz viszonyítva Overlap integrál (J(λ)): a donor emissziós spektrumának és az akceptor abszorbciós spektrumának átfedését jellemző érték Referencia fluorofór és donor optikai denzitások (ODR, ODD): egy referencia fluorofór (NATA) és a donort tartalmazó fehérje abszorbciói adott hullámhosszon Akceptor (mantdATP) moláris extinkciós koefficiens (εA) EredményekTranszfer hatékonyság meghatározása 6. ábra A triptofán szenzor tesztelése Különböző swich-1 konformációs állapotok a nukleotidkötő hely állapota szerint. Mérési beállítások: gerjesztés 295nm-en, ATP kötés: 34%-os csökkenés, 9nm kékeltolódás; ADP kötés: 21%-os csökkenés, 7nm kékeltolódás a nukleotid mentes állapothoz képest (apo). 8. ábra 9. ábra 10. ábra A miozin titrálása ADP-vel A miozin motordomén spektrumai különböző ADPBeFx nukleotid analóg koncentrációk mellett (donor az akceptor hiányában). 20μM ADP (15,6 μM miozin, 200μM BeCl2, 5mM NaF mellett) lényegében teljesen telíti az aktív helyeket. Mérési beállítások: gerjesztés 295nm-en, emisszió detektálás 300-420nm között, rések a gerjesztási/emissziós oldalon 1/1nm, emisszió felbontás 3nm, adott hullámhosszhoz tartozó detektálási idő 1mp, Raman korrekció. A miozin titrálása mantADP-vel (Inner filter effektus karakterizálása) A miozin titrálása a mantATP fluoreszcens nukleotid analóggal (15,6μM miozin, 200 μM BeCl2, 5mM NaF). A mantATP kis feleslegben is fluoreszcens hátteret okoz és torzítja a spektrumokat (inner filter effektus). Mérési beállítások: gerjesztés 295nm-en, emisszió detektálás 300-520nm között, rések a gerjesztási/emissziós oldalon 1/1nm, emisszió felbontás 3nm, adott hullámhosszhoz tartozó detektálási idő 1mp, Raman korrekció. A mantADPBeFx telítési pontjának meghatározása A 9. ábrán felvett spektrumok donor-, illetve akceptorcsúcsainak intenzitásértékeit ábrázoltuk a nukleotid analóg koncentrációja szerint. A piros pontsor a donorcsúcsok csökkenését, a zöld az akceptorcsúcsok emelkedését mutatja. A két pontsorra két-két egyenes illeszthető. Az egyes pontsorok egyenesei közel a fehérjével ekvivalens koncentrációnál (15,6μM) metszik egymást. Azaz ekvivalens, vagy közel ekvivalens mantADP hozzáadásával telíthető a fehérje. Ezt alátámasztják az ADPAlF4-al (ATP nukleotid analóg) végzett kísérletek, ahol előre komplexáltuk az ADPBeFx nagy feleslegével a miozint, és ezután titráltunk mantADP-vel. A sötétkék pontsor a donorcsúcs intenzitáscsökkenése, a világoskék az akceptorcsúcs intenzitásnövekedése. Mindkét pontsorra egy-egy egyenes illeszthető, amelyek párhuzamosak a mantADPBeFx kötött állapot telítés utáni egyeneseivel. A 9. ábrán minden mérési pont két párhuzamos mérés átlaga. A fentiek miatt az energia transzfer számításához a 20μM ADP és mdADP melletti donorcsúcsokat vettük figyelembe. Ez alapján a számított transzfer hatékonyság 0,48. 5. ábra A preparálási és tisztítási lépések ellenőrzése SDS-PAGE segítségével: protein létra (Invitrogen Benchmark, 1.); a motordomén oszlopra vitelénél a távozó eluens (2.); alacsony ionerejű pufferrel való mosás eluense (3.); magas ionerejű pufferrel való mosás eluense (4.); alacsony ionerejű pufferrel való mosás eluense (5.); 10V/V%-os imidazol melletti mosás eluense (6.); 90V/V% imidazol melletti mosás eluense (a miozin motordomén leszorítása) (7.); pozitív kontroll (8.); CBB R250 festés. 7. ábra A miozin fluoreszcencia intenzitása az idő függvényében. A bazális (aktin nélküli) ATP-áz aktivitás mérés alapján az enzimaktivitás 0,08 1/mp (3μM miozinhoz mérés közben adtunk 15μM ATP-t; gerjesztés 295nm, detektálás 341nm). A kvantum hatásfok és az overlap integrál meghatározása A Förster távolság meghatározása Az 50%-os transzfer hatékonysághoz tartozó távolságot a fenti egyenlet alapján számítottuk. Az orientációs faktor értékét ⅔-nak vettük (ez a dipólok gyors és szabad rotációját feltételezi), mivel jelenleg nem állnak rendelkezésre megfelelő anizotrópia eredmények és in silico számítások a κ2 közelítő értékének meghatározására. Az így kapott Förster távolság 4 Angström. Anizotrópia mérések A donor kvantum hatásfokának meghatározása (QD) Felvettük egy referencia fluorofór (N-acetil-L-triptofán-amid, NATA) és a W239.ADPBeFx abszorbciós spektrumát. A QR értéke 0,13 280nm-en. Mivel a W239.ADPBeFx és a NATA integrált emissziós fluoreszcencia intenzitásait 295nm-es gerjesztés mellett határoztuk meg (nincsenek feltüntetve), a QR értékét konvertáltuk a 295nm-es gerjesztéshez tartozó értékre. Az abszorbciós spektrum felvételéhez használt NATA koncentráció 13,1μM (abszorbciós spektrumból, εNATA=5500 M-1cm-1 280nm-en). A 295nm-nél mért NATA abszorbancia értéket is korrigáltuk, mivel a fehérje koncentrációja nagyobb volt. A refrakciós indexek négyzetének hányadosát egynek vettük. Ezek alapján a számított donor kvantum hatásfok 0,011-nek adódik. Mérési beállítások: abszorbancia detektálás 240-320nm, a felvételi sebesség nagyon lassú, rés 1nm, felbontás 1nm, alapvonal korrekció a mérési pufferre. 14. ábra 15. ábra 11. ábra A donor fluoreszcens spektumai horizontálisan (90°)vagy vertikálisan (0°)irányított gerjesztő és emittált fény mellett (az akceptor nincs jelen). Két polarizátor (a gerjesztési és detektálási oldalon) és azok két lehetséges iránya mellett négy spektrum adódik (15,6μM miozin, 20μM ADP, 200μM BeCl2, 5mM NaF). Műszer beállítások:gerjesztés 295nm, emisszió detektálás 300-420nm között, rések a gerjesztási/emissziós oldalon 1/1nm, emisszió felbontás 1nm, adott hullámhosszhoz tartozó detektálási idő 0.2mp, Raman korrekció. A donor spektumai négyféle a polarizátor kombináció mellettaz akceptor jelenlétében (15,6μM miozin, 20μM ADP, 200μM BeCl2, 5mM NaF). A műszer beállításai megfelelnek az előzőeknek (detektálás 300-540nm). 13. ábra Donor-akceptor távolság meghatározás A Förster távolság és a transzfer hatékonyság ismeretében a triptofán donor (W239) indol gyűrűje és a mant akceptor közötti számított távolság 4,1 Angström. 12. ábra Az overlap integrál számítása A donor emissziós spektruma az akceptor nélkül (11. ábra) (15,6μM miozin, 20μM ADP, 200 μM BeCl2, 5mM NaF). Az akceptor abszorbciós spektrumából (12. ábra) elnyelési koefficienseket számítottunk minden hullámhosszon. A fenti összefüggés alapján a számított overlap integrál érték 5,1*1013 M-1cm-1nm-4 (normalizált az FD görbe alatti területre, 11. ábra). A bemért mantATP koncentráció 15,4μM (εNATA=5800 M-1cm-1 356nm-en). 16. ábra 17. ábra A G faktor és az r értékek meghatározása a 14. és 15. ábrák spektrumaiból. A G faktor a műszert jellemző érték, a 90°/0° és a 90°/90° (rendre a gerjesztési és emissziós oldal) polarizátor állások mellett felvett spektrumok hányadosa. Az r érték (a fluoreszcens életidő és a rotációs korrelációs idő ismeretében) jellemzi a donor és az akceptor rigiditását, egymáshoz viszonyított térbeli orientációját. Az r érték a 0°/0° 0°/90° spektrumokból számítható. • Következtetések • Az eddigi eredmények alátámasztják, hogy az F239W miozin motordomén mutáns és a FRET alkalmazásával közvetlen szerkezeti információkat kaphatunk a switch-1 hurok működéséről. • A módszer az elméleti háttér alapján ideális a miozin konformációs állapotainak detektálására aktin jelenlétében (az aktomiozin komplex nem kristályosítható). • A mért adatok alapján számított Förster- és donor akceptor távolság további megfontolást igényel. • Hogyan tovább? • Az eddigi mérések reprodukálhatóságának vizsgálata • A donor és az akceptor rigiditásának és relatív térbeli helyzetének meghatározása • A switch-1 hurok működésének vizsgálata aktin mellett