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Cromatografía

Cromatografía. Técnica bioquímica en la que sustancias mezcladas se separan en función de su carga , hidrofobicidad , tamaño o alguna otra propiedad , al repartirse entre una fase móvil y una fase estacionaria. Muestra aplicada. Eluyente. Volumen de columna. Matriz. Tapón

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Cromatografía

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Presentation Transcript

  1. Cromatografía Técnicabioquímica en la quesustanciasmezcladas se separan en función de sucarga, hidrofobicidad, tamaño o algunaotrapropiedad, al repartirse entre unafasemóvil y unafaseestacionaria Muestra aplicada Eluyente Volumen de columna Matriz Tapón poroso Eluyente Proteínas separadas

  2. Matriz de la columna: (Faseestacionaria o lecho de la columna). Matriz ó sustanciaempaquetadaen la columnaqueestáempapada de solvente y quese. • FaseMóvil. Solucióntamponadaquepasaa través de la columna. • Longituddel dispositivo en el que se empaqueta la columna: Esimportante en algunostipos de cromatografíacomo la de filtración en gel y pocoimportante en otrascomo la cromatografía de afinidad. • Volumen de la columna. (Geométrico) Volumentotal de la matriz ó gel que se empaqueta en unacolumnacromatográfica. • Volumenmuertode la columna. Cantidad de solventequetienequeatravesar la columna para asegurarque se ha reemplazadocompletamente.

  3. Cromatografía de exclusión molecular ó filtración en gel PRINCIPIO: Separación en función del tamaño APLICACIONES • Desalado de proteínas • Purificación de proteínas • Determinación de la masa molecular de proteínas TIPOS DE MATRIZ: Perlas de polímeros entrecruzados con poros de un tamaño determinado • Dextranosentrecruzados • Agarosa • Poliacrilamida

  4. Cromatografía de exclusión molecular ó filtración en gel PRINCIPIO: • Tamaño de partícula y masa molecular. • Mayor masa molecular eluye primero • El gel retiene particuas de menor masa molecular

  5. FASE ESTACIONARIA En estapráctica se utilizará el matriz-gel dextrano.

  6. Desventajas: No se pueden obtener fracciones de proteínas altamente purificadas si se parte de una mezcla compleja de proteínas

  7. Fraccionar extractos proteicos Cromatograma Detección de proteína

  8. Perfil de elución de extractos proteicos de 0, 12 y 24 h de germinación de maíz

  9. Ejemplo: Mezcla de proteínas Mezcla de proteínas Conalbúmina + Feritina MW (kDa) 75 440

  10. FASE ESTACIONARIA En estapráctica se utilizará el matriz-gel dextrano.

  11. Ejemplo: Ferritina NaCl Conalbúmina

  12. Ejemplo:

  13. kDa MASA Å Å TAMAÑO

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