Modul Molekularbiologie und Biochemie der Pflanzen WS 09/10 Praktikum

1. Modul Molekularbiologie und Biochemie der Pflanzen WS 09/10 Praktikum Bioenergetik, Stoffwechsel und pflanzliche Molekularbiologie 15.-19.02.10 Abbildungen zur SDS-PAGE und zum Western Blot

2. Modul Molekularbiologie und Biochemie der Pflanzen Praktikum Bioenergetik, Stoffwechsel und pflanzliche Molekularbiologie Fotos Western Blot: Gruppen 1 und 5 SDS-PAGE Verwendete Proteinmärker Gel # 1 Proteinfärbung nach dem SDS-PAGE: Proteinkontrolle zum Nachweis von PAL und CHS nach Blotting Probenauftrag Gele 1-4 (L  R): Marker (s.o.) RE Kontrollzellen RE Zellen mit 1 nM Pep13 RE Zellen mit 10 nM Pep13 RE Zellen mit 100 nM Pep13 RE Zellen mit 1 µM Pep13 RE Zellen mit 50 µM AgNO3 Marker Gel # 5 Proteinfärbung nach dem SDS-PAGE: Proteinkontrolle zum Nachweis von RubisCO nach Blotting Probenauftrag Gele 5-6 (L  R): Marker (s.o.) RE Spinatblatt (1) RE Spinatblatt (2) RE Gartenkresse-Blatt RE Maisblatt RE Kontrolle Kulturzellen Re Zellen mit 1µM Pep13 Marker

3. Modul Molekularbiologie und Biochemie der Pflanzen Praktikum Bioenergetik, Stoffwechsel und pflanzliche Molekularbiologie Fotos Western Blot: Gel # 2 Zum Nachweis von PAL Protein-Färbung des SDS-PAGE-Gels nach dem Blotting Membranfärbung nach dem Blot mit Ponceau-Rot Peroxidase-Enzymreaktion nach Inkubierung mit Anti-PAL-Primärantikörpern Fazit: Protein gut aus dem Gel auf die Membran übertragen Ein starker immunchemischer Signal bei einem Protein knapp > 70 kD und ein schwächerer bei ca. 50 kD. Beide Signale unspezifisch, da gute Reaktion überall vorhanden, unabhängig von Pep13-Behandlung

4. Modul Molekularbiologie und Biochemie der Pflanzen Praktikum Bioenergetik, Stoffwechsel und pflanzliche Molekularbiologie Fotos Western Blot: Gel # 3 Zum Nachweis von CHS und von PAL nach Immunoabsortion Membranfärbung nach dem Blot mit Ponceau-Rot Protein-Färbung des SDS-PAGE-Gels nach dem Blotting Peroxidase-Enzymreaktion nach Inkubierung mit CHS-Primärantikörpern und mit Anti-PAL-Primärantikörpern nach versuchten Immunoabsorption von unspezifischem 70 kD-Protein Fazit: Protein gut aus dem Gel auf die Membran übertragen Immunchemische Signale wie für Gel #2, wenn auch etwas schwächer. D.h. keine sichtbare Reaktion auf CHS; versuchte Immunoabsorption von Antikörpern gegen unspezifischem 70 kD-Protein im Anti-PAL-Serum (s. Gel # 4) nicht geglückt!

5. Ausschnitt des 70 kD_Proteins aus dem Membran nach dem Blot zur Immunoabsorption mit dem PAL-Antiserum Modul Molekularbiologie und Biochemie der Pflanzen Praktikum Bioenergetik, Stoffwechsel und pflanzliche Molekularbiologie Fotos Western Blot: Gruppe 4 Bereitstellung von 70 kD-Protein zur Immunoabsorption von unspezifischen Proteinen, die mit Anti-PAL-Antiserum reagieren Protein-Färbung des SDS-PAGE-Gels nach dem Blotting Membranfärbung nach dem Blot mit Ponceau-Rot (Protein gut aus dem Gel auf die Membran übertragen) Das ausgeschnittene Membranstuck entsprechend Protein von ca. 70 kD, das unspezifisch mit unseren Anti-PAL-Serum reagiert, wurde mit TBS-Milchpulver blockiert und dann für eine Stunde mit Anti-PAL-Serum (1:1000 Verdünnung in TBS-Milchpulver) inkubiert Diese versucht Immunoabsorption der unspezifischen Antikörper war aber nach dem Enzym-Nachweis mit dem Membran von Gel # 3 (s.o.) aber nicht erfolgreich!

6. Modul Molekularbiologie und Biochemie der Pflanzen Praktikum Bioenergetik, Stoffwechsel und pflanzliche Molekularbiologie Fotos Western Blot: Gel # 6 Zum Nachweis von RubisCO Membranfärbung nach dem Blot mit Ponceau-Rot Protein-Färbung des SDS-PAGE-Gels nach dem Blotting Peroxidase-Enzymreaktion nach Inkubierung mit Anti-RubisCO-Primärantikörpern Fazit: Protein gut aus dem Gel auf die Membran übertragen Ein starker immunchemischer Signal bei einem Protein von ca. 50 kD (≈ große Untereinheit von RubisCO) in den Blattproben, aber nicht bzw. Kaum in den Kulturzellproben Signal spezifisch für RubisCO, auch wenn einige weitere Reaktionen ersichtlich sind