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Molekulargenetische AB0-Typisierung

Molekulargenetische AB0-Typisierung. Dr. G. Heymann. Einsatzgebiete. Serologische Bestimmung ist unmöglich: Vortransfusion KMT Serologie ergibt unklare Ergebnisse Pränataldiagnostik Familienstammbaum wissenschaftliche Fragestellungen. Bisherige Fragestellungen.

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Molekulargenetische AB0-Typisierung

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Presentation Transcript

  1. Molekulargenetische AB0-Typisierung Dr. G. Heymann

  2. Einsatzgebiete • Serologische Bestimmung ist unmöglich: • Vortransfusion • KMT • Serologie ergibt unklare Ergebnisse • Pränataldiagnostik • Familienstammbaum • wissenschaftliche Fragestellungen

  3. Bisherige Fragestellungen • Antigenseite paßt nicht zur Serumseite • schwaches Antigen? • Serumseite paßt nicht zur Antigenseite • multiple Vortransfusion • auffälliger Bed-side Test • Neugeborenes / Mutter • Chimärismus

  4. Bisherige Fragestellungen II • Von 157 ausgewerteten Untersuchungen • betrafen 57 (36%) AB0-System • im Vergleich: • Rhesus 80 (51%), HTLA 11 (7%), andere (MNS, K, Fy, Jk) 9 (6%) • Im AB0-System konnten 67% problemfrei aufgeklärt werden. • Weitere 16% ergaben bedingt ein Ergebnis.

  5. Bisherige Fragestellungen III Ca. 25%

  6. Generelle Probleme • Nachweis eines Polymorphismus der AB0-Transferase ist nur indirekte Blutgruppen-bestimmung. • Bestimmung einer Variante basiert allein auf dem Ausschluß von „Unnormalem“. • Molekulargenetische Nomenklatur ist uneinheitlich und nicht mit Serologie vergleichbar.

  7. AB0-Blutgruppen

  8. AB0-Blutgruppen N-Acetylgalaktosamin an verzweigten Ketten

  9. Sequenzen Exon 6 Exon 7 Spezifisch für 0 0o2 0o3 A104 A204 Ax02 0o8 0o9 A102 A103 Ael02 0o3 A204 A206 0o9 A203 024 A204 A206 Spezifisch für B Spezifisch für B Spezifisch für B 0o8 A302 Aw02 Aw03

  10. Prinzip der PCR-SSP Genomischer DNA-Doppelstrang bei Erhitzung auf >92°C denaturiert.

  11. Prinzip der PCR-SSP Primerannealing bei 37 - 72°C 5´ Antisenseprimer 3´ 3´ Senseprimer 5´

  12. Prinzip der PCR-SSP Elongation durch Taq-Polymerase bei 72°C Wiederholung Denaturierung, Annealing und Elon- gation, bis PCR-Cyclen beendet. 5´ 3´ 3´ 5´

  13. Auflösungsvermögen • Die PCR-SSP erkennt (nur!?) bekannte Varianten • Watanabe 8 Mixe A/01,B/01,01,01,02,B,A2,Alle(A2) • Kommerziell 8 Mixe 01, n01, 02, n02, B, nB, A2, nA2 • InnoTrain, BAG • Eigene PCR 48 Mixe • Hannover 96 Mixe • Ausschluß um so besser möglich, je mehr Varianten erkannt werden.

  14. Besondere BefundePruß A, Heymann GA et al., Acute intravascular hemolysis after transfusion of a chimeric RBC unit. Transfusion 2003; 43: 1449-51

  15. Besondere Befunde Spenderin wurde initial als B bestimmt. Beim Bed-side Test aus Konserve fiel ein schwaches A auf. 523 526 721

  16. Prinzip der Sequenzierung Primerannealing bei 37 - 72°C nach Denaturierung 5´ 3´ 3´ Sequenzierprimer 5´

  17. Prinzip der Sequenzierung Elongation durch Taq-Polymerase bei 72°C bis Kettenabbruch Wiederholung Denaturierung, Annealing und Elon- gation, bis Cyclen beendet. Es entstehen verschieden lange Ketten, die aufgetrennt werden können. 3´ 5´

  18. Nondeletionale 0 AlleleA. Seltsam, Arbeitsgruppentagung, Hannover 2004 • Es gibt AB0-Transferase, die keine Deletion an 261 zeigen, jedoch eine große Anzahl von Mutationen aufweisen. • Diese „0-Allele“ zeigen kaum Aktivität. • Es kommt jedoch, zumindest bei 0o3, zu einer nachweisbaren Menge von A auf den Erys. Dies reicht aus, um Isoagglutinine zu supprimieren. • Bisher hier 4 Fälle mit antigenseitig 0, serumseitig A.

  19. Nomenklatur • Die Allele wurde v.a. nach der serologischen Reaktivität der Erstbeschreibung benannt. • Diese deckt sich fast nie mit der Reaktivität der gleichen Allele bei späteren Patienten. • Beispiele für Benennung: • 0o1: auch 01, 0a • 0o6: auch 0v1, 0tlse1 • A201: auch A105, A2, Aw-1 • cisAB01: auch C101 • Von 3 Ael Verdachtsfällen waren bisher 2 Ax01 und 1 A104, keines Ael01(A109, Ael1) oder Ael02(A110, Ael2).

  20. Besonderheit: 1 Transferase = 2 Antigene • Es gibt Allele, die eine Konjugierung mit Gal und N-Ac-Gal gleichermaßen vermitteln. • Phänomen des Cis-AB

  21. Kosten • Pro Primer 0,02 Euro60 versch. Primer =1,20 Euro • Für Platin Taq 3,56 Euro • Für PCR-Puffer 1,- Euro • Gel, Photo, Puffer 1,50 Euro • DNA-Isolierung 3,- Euro • kommerziell (BAG) 250,-Euro / 10 Tests • pro Test In House ca. 10,- Euro kommerziell ca. 30,- Euro (weniger Verbrauchsmaterial) • Dauer: min. ca. 3 h

  22. Fazit • Die Fragestellung entscheidet essentiell über den Aufwand, der betrieben werden muß. • Die Ursache für serologisch unklare AB0-Bestimmungen ist nur in seltenen Fällen eine Mutation. • Es ist meist keine direkte Aussage zur vermutlichen serologischen Reaktivität möglich.

  23. Literatur zum Nachlesen • Zur PCR: • Watanabe et al. Human Genetics 1997;99;34-37 • Yip. Blood 2000;95;1487ff • Gassner et al. Blood 1996; 88; 1852-1856 • Zu einzelnen Allelen: • Yamamoto et al. Vox sanguinis 1993; 64; 116-119 und 171-174 und 175-178 • Yamamoto et al. Vox sanguinis 1995; 69; 1-7 • Olsson et al. Blood 2001; 98; 1585ff • Im Internet: • Blood Group Antigene Gene Mutation Database:http://www.bioc.aecom.yu.edu/bgmut/abo.htm

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