流式细胞仪分析技术及应用

流式细胞仪 分析技术及应用上海交通大学医学院丁磊副教授

Laser FALS Sensor 流式细胞术(FCM)定义: FCM是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。

特点: 单细胞的流动的活细胞的定量的多参数的高统计学精度的分选细胞

一、流式细胞仪的分析及分选原理 二、数据的显示与分析三、流式细胞仪分析的技术要求四、流式细胞术应用

流式细胞仪的分析及分选原理 一工作原理： FCM是一种在计算机技术支持下的高度自动化的细胞显微荧光脉冲分光光度仪。

(一）基本组成结构 1、液流系统样品流和鞘流 2、光学系统激光、透镜组、光电倍增管等。 3、数据处理系统

1、液流系统 样品流和鞘流 Injector Tip Sheath fluid 荧光信号激光束

流动室 Flow Cell 孔径50-200m 检测区离喷口200m 有分选功能 Laser

液流驱动系统（示意图） 流速与压力的关系服从Bernoulli方程，即 P=(1/2)V2 (忽略高度的变化)。改变气压,就可获得不同的流速。

2、光学系统 激光、透镜组、光电倍增管等。 PMT 4 PMT Dichroic 3 Flow cell Filters PMT 2 Bandpass Filters PMT 1 Laser

E1 E1 E1 hv hv hv hv hv E0 E0 E0 自发辐射受激辐射吸收当物质受到强烈激励,使某一能级的粒子数大量积聚, 发生粒子数反分布.如有光束入射,入射光子与粒子发生完全弹性碰撞,使粒子从激发态跃迁到基态同时发生一个光子.光子的能量与入射光子能量相同,有一致的方向和恒定的位相关系,这种发射称受激发射.

球透镜和柱面透镜： 20×200m椭圆形光，短轴和细胞流平行，长长轴与细胞流垂直。光束成形与细胞受照方式

光束成形与细胞受照方式 这种椭圆形光斑的检测区保证每个细胞分别受到光照且受检时受到一致的光照FCM的单细胞照明技术. 激发光焦斑

（二）基本工作原理

单细胞流：流动室

单细胞照明：激光 488 nm laser

单细胞检测：信号处理 488 nm laser

二散射光的测定 （一）前向散射光 (foword scatter)：FSC 信号的强弱与细胞的大小相关（二）侧向散射光（side scatter)：SSC 信号的强弱与细胞内的颗粒多少相关

Forward Angle Light Scatter Laser FALS Sensor 细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.

90 Degree Light Scatter Laser FALS Sensor 90LS Sensor 细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.

前向散色光FSC

侧向散色光SSC

散射光的测定 利用前向角和测向角散射光可以把外周血白细胞分成三群，淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。

三荧光测量 荧光检测器检测特定荧光的特定发射波长（一）光信号测量线性放大器对数放大器

350 457 488 514 610 632 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Common Laser Lines PE-TR Conj. Texas Red PI Ethidium PE FITC cis-Parinaric acid

Emisson Excitation 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm DNA

（二）荧光补偿 利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻荧光通道的信号加以扣除的技术称“荧光补偿”

荧光补偿

四细胞分选原理 + （一）分选的基本原理 FALS Sensor 488 nm laser Fluorescence detector - Charged Plates Single cells sorted into test tubes

MACS-Magnetic Cell Sorting 磁珠分离 阳性选择阴性选择

（二）分选的技术要求 1 、分选速度：几千个细胞/秒 2 、分选纯度:99.5%左右 3 、分选收获率:90-95% 4 、分选得率

分选纯度 是指分离后的样品中该亚群细胞所占的百分比。分选收获率是指分离后所得的细胞亚群数占原细胞样品中该亚群细胞数的百分比。

数据的显示和分析 一、参数前向散射光FS: 反映颗粒的大小侧向散射光SS: 细胞内部结构复杂程度荧光FL: 细胞被染上荧光部分数量的多少

二、数据的显示方式 （一）单参数直方图显示（二）双参数显示（三）三参数显示

(一) 单参数直方图的显示 Single-Parameter Histogram Displays 以分布直方图( distribution histogram ) 来显示，横轴为该参数测量强度相对值，单位是道数。强度分布可以是线性的，也可以是对数的。纵轴一般是细胞数或细胞出现的频数。

X轴表示绿荧光信号(CD3)强弱,Y轴则反应细胞的数量.X轴表示绿荧光信号(CD3)强弱,Y轴则反应细胞的数量.

(二)双参数数据的显示 Two-Parameter Data Displays 细胞双参数测定不仅能提供二个参数各自与细胞数量的关系，更重要的是获得了这二个参数之间的相关关系，其中包含了更多的生物学信息。双参数数据显示最常用的是二维的散点图( Dot Plot )。在二维图上，横轴代表第一个测量参数，纵轴代表第二个测量参数。

1 、点图 纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数,在图中每一个点代表一个细胞

双参数点图

2 、二维等高图 用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相同，不同的等高线上细胞数不同。

3 、假三维等高图 纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数,Z轴为细胞数。

(三) 三参数直方图 三维坐标匀为参数（散射光或荧光）而非细胞数。

（四）流式细胞仪的多参数分析 一般利用所得参数的两两组合并利用设门（Gate) 技术，来分析参数之间的相互关系。

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