Sitronsyresyklusen

1. Sitronsyresyklusen Winnie Eskild, IMBV 2004

2. Sitronsyresyklus • Felles sluttpunkt for nedbrytning av karbonforbindelser • Her ender karbon-atomene som CO2

3. Sitronsyresyklus foregår imitokondriene • To membraner, indre og ytre • Ytre membran er glatt • Små molekyler passerer • Indre membran foldet i kristae • Ikke permeabel • Spesifikk transportør for hver type molekyle som får passere • Cellens kraftverk • ATP syntese • Egen reproduksjon • Egne gener for en del proteiner • Matriks: høy enzymkons. DNA Kristae Matriks Ribosomer Indre membran Ytre membran

4. Fullstendig nedbryting av glukose- en tretrinnsprosess • Fullstendig nedbryting av glukose og omdannelse av den utvundne energien til ATP foregår i 3 trinn • Første trinn er glykolysen • Et mellomtrinn omdanner pyruvat til acetyl-CoA • Acetyl-CoA poolen mottar også nedbrytnings-produkter fettsyrer og aminosyrer • Andre trinn er sitronsyresyklusen • Tredje trinn er oksidativ fosforylering

5. Første trinn: omdannelse til acetyl-CoA • Karbohydrater, fettsyrer og aminosyrenes karbonskjelett brytes ned til enheter bestående av 2 karbonatomer (acetylgruppen) som koples til CoA-SH

6. Annet trinn: Sitronsyre syklus • Nedbryting av acetyl-gruppen • For hver acetylgruppe får en • 8 elektroner ( 3 NADH + FADH2) • 1 ATP (GTP) • For hver fullført syklus får en gjendannet oksaloacetat

7. Tredje trinn: Oksidativ fosforylering • For hvert elektronpar fra NADH fås 2,5 ATP • For hvert elektronpar fra FADH2 får 1,5 ATP

8. Pyruvat transporteres inn i mitokondriet • Nedbryting av karbohydrater foregår i cytosol, mens sitronsyresyklusen foregår i mitokondrie-matriksen. • Pyruvat må derfor først transporteres inn i mitokondriematriks. • Pyruvat translokase i indre mitokondremembran overfører pyruvat. Symport med H+.

9. Mengden av acetyl-CoA viktig for valget mellom sitronsyresyklus og glukoneogenese • Pyruvat dehydrogenase komplekset er et viktig hastighetsregulerende trinn i sitronsyre syklus (SSS) • Pyruvat karboksylase er et viktig hastighetsregulerende trinn for glukoneogenese og for en av de anaplerotiske reaksjonene som bidrar med mere oksaloacetat til SSS • Acetyl-CoA er allosterisk regulator

10. Pyruvat dehydrogenase kompleksetFem ganger så stort som ribosomet hos pattedyr og synlig i elektronmikroskopet

11. Pyruvat dehydrogenase komplekset 3 enzymer: • Pyruvat dehydrogenase = E1 (+ TPP) • Dihydrolipoyl transacetylase = E2 (+ lipoat) • Dihydrolipoyl dehydrogenase = E3 ( + FAD) 5 kofaktorer: • Tiaminpyrofosfat (TPP) kofaktor for E1 • FAD+ kofaktor for E3 • Coenzym A • NAD+ • Lipoat kofaktor for E2 2 regulatoriske proteiner • Kinase • Fosfatase

12. Pyruvat til acetyl-CoA • Pyruvat translokase i indre mitokondremembran overfører pyruvat. Symport med H+. • Deretter må pyruvat med 3 C-atomer omdannes til en 2 C-atomenhet og koples til CoA-SH før det kan gå inn i sitronsyresyklusen (SSS) • Dette omdanningstrinnet er et viktig reguleringspunkt som kontrollerer hvor mye substrat som sendes inn i SSS

13. Pyruvat til acetyl-CoA • Pyruvat dehydrogenasekomplekset katalyserer oksidativ dekarboksylering av pyruvat og kopling til acetyl-CoA • Dette mulitenzymkomplekset består av 3 enzymer, 5 kofaktorer og 2 regulatoriske proteiner (kinase + fosfatase)

14. Pyruvat dehydrogenase komplekset

15. Lipoat

16. Coenzym A

17. Dekarboksylering og kopling til TPP • Reaksjonen er en oksidativ dekarboksylering • Pyruvat koples til TPP på pyruvat dehydrogenase • Her dekarboksyleres det og omdannes til hydroksyetyl

18. Dehydrogenering og overflytting til lipoylarmen • Stadig koplet til TPP oksideres hydroksyetyl til en karboksylsyre av E1 og overflyttes til lipoyl-armen sammen med de to ekstraherte elektronene • Elektronene brukes til å redusere disulfid-broen på lipoylarmen. En H+ frigis til miljøet • Acetylgruppen er nå bundet til lipoyl-armen med thioesterbinding, en høyenergi binding

19. Overflytting av acetylgruppen til acetyl-CoA • Dihydrolipoyl transacetylase (E2) overfører acetylgruppen til acetyl-CoA • Her brytes og dannes en høy-energetisk thioesterbinding

20. Reoksiderering av lipoylarmen • Enzymkomplekset må nå regenereres for å kunne ta imot en ny pyruvat • Dihydrolipoyl dehydrogenase (E3) oksiderer lipoyls to SH-grupper og overfører to hydrogenatomer til FAD • FAD omdannes til FADH2

21. Reoksidering av FADH2 • Dihydrolipoyl dehydrogenase oksiderer FADH2 til FAD og overfører to elektroner + en proton til NAD+ • En proton frigis til miljøet

22. Lipoylarmen spiller sentral rolle • Lipoylarmen som sitter på enzym E2, dihydrolipoyl transacetylase, spiller en sentral rolle i funksjonen til dette enzymkompleks • Lipoylarmen flytter substratet mellom E1 og acetyl-CoA. Dette er substratkanalisering, dvs substratet forlater ikke enzymkomplekset før det er ferdig bearbeidet av alle enzymene. • Lipoylarmen flytter elektroner og protoner mellom kofaktoren til E1 og kofaktoren til E3

23. Regulering av pyruvat dehydrogenase komplekset • PDK tilhører ikke direkte SSS, men reguleringen av det er tett knyttet til SSS • Når nivået av acetyl-CoA øker hemmes PDK. Dette fordi acetyl-CoA også dannes ved nedbryting av andre substrater (fettsyrer, aminosyrer) • Allosteriske hemmere: Acetyl-CoA,ATP, NADH. Fettsyrer forsterker denne hemming • Allosteriske aktivatorer: AMP, ADP, NAD+, Ca 2+ , CoA • Kovalent modifikasjon: Reversibel fosforylering av E1 (Ser) • Fosforylering hemmer aktivitet. Kinasen aktiveres allosterisk av ATP • Defosforylering gjenskaper normal aktivitet. Fosfatasen er aktiv hele tiden

24. Sitronsyre- syklus

25. Overblikk over sitronsyre syklus • SSS er en reell syklus (glykolysen er liniær) • SSS består av 8 reaksjoner • Når en ny acetylgruppe sendes inn i SSS, koples den til et intermediat med 4 C-atomer, oksaloacetat • Det 6 C-atom intermediat som oppstår gir fra seg et CO2 og 2 H-atomer to ganger. Andre gangen koples det på et CoA. Dette frigis igjen i en prosess hvor GDP fosforyleres til GTP. Det avgis 2 H-atomer to ganger til og til sist er oksaloacetat gjendannet

26. 1. Reaksjon: Acetylgruppen koples til oksaloacetat • Enzymet er citrat syntase, DG’o = - 32,2 kJ/mol • Lav konsentrasjon av oksaloacetat, men stor negativ G’o driver reaksjonen • Reaksjonen skjer ved at en proton dissosieres fra metylgruppen som derved blir en karbanion • Denne retter et nukleofilt angrep på oksaloacetats karbonyl C-atom • Det dannes et intermediat: citroyl-CoA • Mens det sitter i enzymets aktive sete hydrolyseres thioesterbindingen til CoA

27. Citrat syntase • Først binder oksaloacetat. Dette medfører en konformasjons-endring og åpning av bindingssetet til acetyl-CoA • Acetyl-CoA binder og de to molekylene kondenseres • Dette medfører ny konformasjons-endring som tillater hydrolyse av thioesterbindingen • Mekaninsmen skal hindre at thioesterbindingen hydrolyseres ved en feil

28. 2. Reaksjon: Citrat isomeriseres til isocitrat • Enzymet aconitase katalyserer isomerise-ringen via intermediatet cis-aconitat • DG’o = 13,3 kJ/mol • Reaksjonsmekanismen er en dehydrering og en rehydering og resulterer i flytting av en OH-gruppe • Enzymet er et jern-svovl protein. I det aktive setet har det et jern-svovl senter som deltar i fjerning og gjeninnsetting av H2O

29. 3. Reaksjon: Oksidasjon av isocitrat til a-ketoglutarat • Reaksjonen er en oksidativ dekarboksylering • Enzymet er isocitrat dehydrogenase som bruker kofaktoren NAD+ til å ta imot 2 elektroner og en proton. En proton frigis • DG’o = - 20,9 kJ/mol

30. 4. Reaksjon: Oksidasjon av a-ketoglutarat til succinyl-CoA • Reaksjonen: oksidativ dekarboksylering, DG’o = - 33,5 kJ/mol • Enzymet: a-ketoglutarat dehydrogenase komplekset består av 3 enzymer, lipoylarm og 5 kofaktorer. Multienzym kompleks som pyruvat dehydrogenase komplekset. Samme mekanisme. • En del av den energien som frigis ved dekarboksylering tas vare på i thioesterbindingen • To elektroner og en proton overføres til NAD+. En proton frigis

31. 5. Reaksjon: Hydrolysering av succinyl-CoA til succinat • Energien som frigis ved hydrolyse av thioesterbindingen brukes til å danne en anhydridbinding ved fosforylering av GDP til GTP • Substratnivå fosforylering!! • Enzymet er succinyl-CoA syntetase • Enzymet fosforyleres som en del av den katalytiske mekanisme • GTP + ADP <=> GDP +ATP • Nukleosid difosfat kinase

32. Succinyl-CoA syntetase • Succinyl-CoAs thioesterbinding hydrolyseres og energien brukes til å fosforylere succinat • Succinylfosfat hydrolyseres og energien brukes til å fosforylere en His i enzymets aktive sete • GDP fosforyleres ved å hydrolysere av His-P på enzymet • DG’o = - 2,9 kJ/mol

33. 6. Reaksjon: Oksidasjon av succinat til fumarat • Enzymet er succinat dehydrogenase • Et flavoprotein (FAD er kofaktor) med jern-svovl senter • FAD har mere positivt E’o her enn NAD+, pga sin sterke binding til enzymet • To H-atomer ekstraheres • Enzymet har Fe-S-senter og er tett bundet til mitokondrie-matriksens indre membran • De to elektronene FADH2 bærer kanaliseres direkte til elektrontransport-kjedens enzymer og videre til oksygen => syntese av 1,5 ATP

34. 7. Reaksjon: Hydrering av fumarat til L-malat • Enzymet fumarase katalyserer reversibel hydrering av dobbeltbindingen • Enzymet er sterkt stereospesifikt. Det kan ikke bruke cis-isomeren av fumarat som er maleat og danner bare L-malat • DG’o = - 3,8 kJ/mol H2O

35. 8. Reaksjon: Oksidasjon av malat til oksaloacetat • Enzymet malat dehydrogenase oksiderer malat til oksaloacetat • To H-atomer ekstraheres. To elektroner og en proton overføres til NAD+, en proton frigis • Det er svært lite oksaloacetat i mitokondriet og det fjernes rask ved kopling til acetyl-CoA • Ved hele tiden å fjerne oksaloacetat tvinges reaksjonen mot dannelse av oksaloacetat

36. Sitronsyre syklus Output Input 2 CO2 8 elektroner 1 GTP/ATP 1 CH3-C- O acetylgruppe

37. Karbonatomenes vandring gjennom SSS • De 2 C-atomer som koples til oksaloacetat forblir i syklusen minst en syklus • De 2 C-atomer som frigis stammer fra oksaloacetat

39. Energiutbytte • 2 elektroner fra NADH => syntese av 2,5 ATP • 2 elektroner fra FADH2 => syntese av 1,5 ATP • Totalt ATP utbytte ved fullstendig oksidasjon av glukose = 32 ATP • 32 ATP krever 32 X 30,5 kJ/mol = 976 kJ/mol • Total oksidasjon av glukose = 2840 kJ/mol • Totalt utbytte teoretisk = 34% • Forholdene i cellen er ikke standardiserte derfor representerer utbyttet i virkeligheten ca 65% av det som er tilgjengelig

40. Sitronsyresyklus er en amfibol reaksjonvei- intermediater fylles på og hentes ut • Intermediater fra SSS brukes til syntese av mange forskjellige biomolekyler

41. Sitronsyreintermediater brukes til syntese av mange biomolekyler

42. Anaplerotiske reaksjoner fyller på med ekstra SSS-intermediater

43. Anaplerotiske reaksjoner fyller på med ekstra SSS-intermediater

44. Anaplerotiske reaksjoner tilfører SSS-intermediater, spesielt oksaloacetat Konsentrasjonen av SSS-intermediatene holdes konstant SSS-intermediater brukes til syntese av andre forbindelser Viktigste ana-plerotiske reaksjon er karboksylering av pyruvat til oksalo-acetat

45. Pyruvat karboksylase • Enzymet er allosterisk regulert • Acetyl-CoA er både substrat og positiv allosterisk regulator • Enzymet bruker kofaktoren biotin, en bærer av 1-C-enheten CO2 • Biotin er koplet kovalent (amidbinding) til -NH2-gruppe i enzymet • Biotin bærer substratet fra 1. til 2. aktive sete, substratkanalisering • 1. Nitrogen i biotin angriper (nuklefilt) C-atomet i HCO3-. Samtidig angripes -P-atomet i ATP av et oksygen i HCO3- • CO2 overføres til biotin og ATP spaltes i ADP og Pi. Aktivert CO2 • 2. Karboksybiotinyl angripes av pyruvat (enolform) og som får CO2 overført og omdannes til oksaloacetat

46. Regulering av SSS • Regulering skjer 3 nivåer: • 1) Tilgang på substrat • 2) Produkthemming • 3) allosterisk regulering • Citrat syntase • Stimulerer: • ADP • Hemmere: • NADH, • succinyl-CoA, • citrat, ATP • Isocitrat dehydrogenase • Stimulatorer: Ca 2+ , ADP • Hemmere: ATP • a-ketoglutarat dehydrogenase • Stimulator: Ca 2+ • Hemmere: NADH, succinyl-CoA Citrat syntase

47. Regulering av SSS • Regulering skjer 3 nivåer: • 1) Tilgang på substrat, 2) Produkthemming og 3) allosterisk regulering • Citrat syntase • Stimulerer: ADP • Hemmere: NADH, succinyl-CoA, citrat, ATP • Isocitrat dehydrogenase • Stimulatorer: • Ca 2+ • ADP • Hemmere: • ATP • a-ketoglutarat dehydrogenase • Stimulator: Ca 2+ • Hemmere: NADH, succinyl-CoA Isocitrat dehydrogenase

48. Regulering av SSS • Regulering skjer 3 nivåer: • 1) Tilgang på substrat, 2) Produkthemming og 3) allosterisk regulering • Citrat syntase • Stimulerer: ADP • Hemmere: NADH, succinyl-CoA, citrat, ATP • Isocitrat dehydrogenase • Stimulatorer: Ca 2+, ADP • Hemmere: ATP • a-ketoglutarat dehydrogenase • Stimulator: • Ca 2+ • Hemmere: • NADH • succinyl-CoA -ketoglutarat dehydrogenase kompleks

49. Hemmer fosfofruktokinase-1

50. Glyoksylat syklus Omdannelse av fett til karbohydrat