Протеомика.

1. Протеомика.

4. Цель и задачи протеомики. Конечная цель протеомики – установление и характеристика полного набора белков данного организма. Основные задачи протеомики: - идентификация белков клеток, тканей, биологических жидкостей организма; - определение структуры белков; - установление функциональных свойств белков; - исследование взаимосвязи структуры и функции белков; - выяснение механизмов регуляции активности белков; - изучение межбелковых взаимодействий; - выяснение специфики изменений протеома при заболеваниях; - выявление белков – мишеней, на которые направлено действие лекарственного средства.

5. Структурная и функциональная протеомика. Цель структурной протеомики: установление структуры всех белков живого организма. Задачи структурной протеомики: - выделение и очистка белков протеома; - идентификация белков протеома; - определение первичной, вторичной, третичной структуры белков; - исследование внутримолекулярной динамики белков. Цель функциональной протеомики: определение функциональных свойств протеома. Задачи функциональной протеомики: - установление функций каждого из белков протеома; - предсказание функциональной роли отдельных белков путем сопоставления их качественного и количественного состава в клетке на разных стадиях и в разных состояниях ее развития; - анализ межбелковых взаимодействий; - выяснение взаимосвязи между структурой и функцией белков; - изучение механизмов функционирования белков.

6. Основные протеомные технологии Одно- и двумерное электрофоретическое разделение белков лазерная захватывающая микродиссекция, комбинация методов 2D-электрофореза и времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI), хромато-масс-спектрометрия, микрочиповые технологии (SELDI), биосенсорные технологии

7. Двумерный электрофорез (принцип метода)

8. Методы окраски гелей и количественный анализ 2D-электрофореграмм Кумасси Флюоресценция Серебро Окраска: Чувствительность: • Кумасси голубым ~ 50 нг/пятно • Серебром, совместимая с MS анализом ~1 нг/пятно • Флуоресцентная метка Cy3/Cy5 ~ 0.5 нг/пятно

9. Стратегия анализа: 2DE + MALDI-MS 2D электрофорез белков Компьютерный анализ изображений гелей Вырезание и трипсинолиз белков в фрагментах геля Экстракция пептидов и получение MALDI масс-спектра суммарного гидролизата Поиск в базе данных измеренных масс пептидов (пептидный фингерпринт) TOF-TOF фрагментация отдельных пептидов Поиск в базе данных измеренных масс фрагментов

10. 2D электрофорез белков Получение MALDI масс-спектра суммарного гидролизата Вырезание и трипсинолиз белков в фрагментах геля

11. Времяпролетная МАЛДИ масс-спектрометрия

12. Матрично-ассоциированная ионизация

13. Времяпролетная масс-спектрометрия. Метод основан на разделении в пространстве или во времени, различающихся по отношению массы к заряду предварительно ионизованных частиц. Принцип действия времяпролётного масс-спектрометра основан на том, что при движении ионизированных молекул газа в бесполевом пространстве происходит их разделение на пакеты близких по отношению массы к заряду ионов .

14. Стратегия анализа: 1D - nanoLC + nanoESI-MS/MS 1D электрофорез белков Вырезание и трипсинолиз белков в полосах геля Экстракция и хроматографическое разделение пептидов Получение масс-спектров пептидов и их фрагментации Объединение данных и анализ

15. Стратегия анализа:HPLC - nanoLC + nanoESI-MS/MS HPLC белков+ 1DnanoHPLC-nanoMS хроматографическое разделение пептидов Получение масс-спектров пептидов и их фрагментации Объединение данных и анализ

16. Электроспрейная ионизация

17. Хромато-масс-спектрометр с квадрупольным масс-анализатором. Принцип действия таких безмагнитных масс-анализаторов основан на взаимодействии ионов с высокочастотным электрическим полем специальной формы. Пучок ионов попадает в камеру анализатора, вдоль которой расположены четыре металлических стержня круглой или гиперболической формы. Потенциалы, подаваемые на соседние электроды, равны по величине, но противоположны по знаку, и создается двумерное электрическое поле.

18. Идентификация белка заменяется нахождением его ближайшего гомолога Изучаемый белок обычно отличен от имеющегося в базе данных массы20 кандидатов случайное совпадение достоверный поиск Вероятность (score) 20 кандидатов в порядке убывания достоверности поиска • N Масса Вероятность Описание • gi|8486123 27875 88 reading frame [Influenza A virus] • gi|4996872 26451 74 M1 [influenza A virus (A/Taiwan/96/1769)] • gi|324260 27872 73 M1 subunit [Influenza A virus] • gi|75116 27866 73 M1 - influenza A virus (strain A/WSN/33) • ------------- • 20. gi|6048806 27218 58 M1 [Influenza A virus (A/Duck/Hong Kong/698/79 (H5N3))] перекрывание «совпавшими» пептидами последовательности белка35% IVPSGPLKAE IAQRLEDVFA GKNTDLEVLM EWLKTRPILS PLTKGILGFV FTLTVPSERG LQRRRFVQNA LNGNGDPNNM DKAVKLYRKL KREITFHGAK EIALSYSAGA LASCMGLIYN RMGTVTTEVA FGLVCATCEQ IADSQHRSHR QMVTTTNPLI RHENRMVLAS TTAKAMEQMA GSSEQAAEAM DIASQARQMV QAMRTIGTHH SSSAGLKDDL LENLQAYQKR MGVQMQRFK

19. Критерии достоверности поиска белков в базах данных (МС/МС + пептидный фингерпринт) база данных измеренные m/z Score • Отбор из базы данных всех кандидатов, • содержащих триптические пептиды указанных m/z • 2. «Примерка» спектров фрагментации (MS/MS) : • количество «совпавших» фрагментов пептидов • «уникальность» спектров фрагментации пептидов • 3. Score белка = S Score пептидов Score пептидов

20. СОПОСТАВЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ:2DE + MALDI-MS и 1DE + LC-ESI-MS/MS Protein № NCBI mW score conserved hypothetical lipoproteingi|31541381 85818119 conserved hypothetical lipoprotein gi|31541566100472 130 conserved hypothetical lipoprotein gi|31541571 120325 273 conserved hypothetical lipoproteingi|31541607130197 205 conserved hypothetical lipoprotein gi|31541608 133826 168 Protein № NCBI mW score conserved hypothetical lipoproteingi|31541381 85818127 conserved hypothetical lipoprotein gi|31541566100472 817 HepA/SNF gi|31541753 132618341 conserved hypothetical lipoprotein gi|31541571 120325 2152 conserved hypothetical lipoproteingi|31541607130197 1781 lipoprotein gi|45453612 18284 313 lipoprotein gi|4545363818339 362 lipoprotein gi|33327196 25889 436 conserved hypothetical lipoprotein gi|31541608 133826 1008

21. Посттрансляционные модификации(PTMs)Аминокислотымодифицируются после синтеза белка • Фосфорилирование - добавление фосфатных групп (serine, tyrosine, threonine or histidine) • Ацетилирование - добавление ацетильных групп • (обычно к N-концу белка) • Гликозилирование - добавление гликозильных • групп (asparagine, hydroxylysine, serine, • threonine) с образованием гликопротеинов • Более 100 других модификаций……

22. Масс-спектрометрическое определение пост-трансляционных модификаций белков Модификации in vitro: Модификации белков после их разделения в ПААГ Т9 Лизоцим Т6 Cys + I ацетамид Cys+ акриламид Met окислен Т13 Т13-14 Т11 цистеины алкилированы йодоацетамидом (в геле) Модификации in vivo: Изучение S-S мостов

23. Выявление посттрансляционных модификаций. Двойное окрашивание Pro-Q Emerald (Mol. Prob.) и Sypro Ruby для идентификации гликозилированных белков M.gallisepticum Двойное окрашивание Pro-Q Diamond (Mol. Prob.) и Sypro Ruby для идентификации фосфорилированных белков M.pneumoniae. Авторадиография 2DE ацилированных белков M.gallisepticum, меченых С18

24. Определение фосфорилированных белков 2D электрофорез IPG-strip pH3-6 Вырезание и трипсинолиз белков в геле Обогащение фракции кислых пептидов с помощью системы ClinProtMB-IMAC Fe (Bruker Daltonics) Получение суммарного MALDI масс-спектра очищенных пептидов Выявление пост-трансляционных модификаций (фосфорилирования) белков с помощью МС/МС

25. Определение пост-трансляционных модификации белка DnaK из бактерии Mycoplasma gallisepticum 1 MTMSNNNGLI IGIDLGTTNS CVSVMEGAQK VVIENPEGKR TTPSVVSYKN GEIIVGDAAK RQMLTNPNTI VSIKRLMGTS KKVKINDKGV EKELTPEEVS 101 ASILSYLKDY AEKKTGQKIS RAVITVPAYF NDAERQATKT AGKIAGLTVE RIINEPTAAA LAYGIDKGHR EMKVLVYDLG GGTFDVSLLD IADGTFEVMA 201 TAGDNRLGGD DWDNKIIEWI IAEIKKDHPS LDLKSDKMAM QRLKEAAERA KIELSAQLET LISLPFIAVT PEGPVNAELT LSRAKFEELT KDLLERTRNP 301 IADVLKEAKV DPSQVDEILL VGGSTRMPAV QKLVESMIPN KAPNRTINPD EVVAIGAAVQ GGVLRGDVKD ILLLDVTPLT LAIETLGGVA TPIIKRNTTI 401 PVSKQIFSTA QDNQSESVDV SIYQGERPMA RENKSLGTFS LGGIQPAPKG KPQIEITFNI DANGILNVKA KDLTTGKENS ITISNSSELD ENEIQRMIRD 501 AEANKERDAI VKQRIEMRYE GEGIVNTINE ILGSKEAEAL PAQEKASLTK IVDGINGALK AEKWDELKEQ IDGFKKWRDD MSKKYGGGEA PAEPK 80 Да

26. Метаболомика Метаболомика — это систематическое изучение низкомолекулярных метаболических профилей процессов, протекающих в живых клетках. Метаболом –полный набор метаболитов биологического объекта

27. Общая схема проведения метаболомных исследований

28. Современные методы метаболомики. • Профилирование • Количественное сравнение метаболитов одного класса • HPLC-MS • GC-MS • Fingerprinting • Идентификация метаболитов • Direct MS • HPLC-MS • GC-MS • CE-MS Основные МС направления в метаболомике

29. Области применения метаболических исследований создание новых антибиотиков оценка жизнеспособности эмбрионов, предназна-ченных для искусственного оплодотворения определение токсичности препаратов обнаружение биомаркеров заболеваний диагностика отклонений обмена веществ

30. Интерактомика. 1. Биоинформационные подходы: 1.1. Подходы, основанные на геномной информации 1.2. Подходы, основанные на эволюционных взаимосвязях белков 1.3. Подходы, основанные на трехмерной структуре белка 1.4. Подходы, основанные на белковых доменах 1.5. Подходы, основанные на первичной структуре белков

31. Интерактомика. 2. Экспериментальные подходы 2.1. Геномные подходы · Дрожжевая двугибридная система (yeast two hybrid system) · Синтетические генетические матрицы (synthetic genetic array (SGA) analysis) · Корреляционный профиль экспрессии мРНК (correlated mRNA expression profile) 2.2. Биохимические подходы · Методы на основе твердофазной аффинной хроматографии · Молекулярный фишинг на чипе оптического биосенсора · Масс-спектрометрическая идентификация белков

32. Принцип дрожжевой двугибридной системы

33. Принцип выделения белковых комплексов методом коиммунопреципитации.

34. Принцип аффинного выделения 6xHis-меченого белка в комплексе с белками-партнерами.

35. Принцип тандемной аффинной очистки целевого белка в комплексе с белками-партнерами(Tandem Affinity Purification, TAP).

36. Плазмонный резонанс Схема эффекта поверхностного плазмонного резонанса Поверхностный плазмонный резонанс (англ. Surface plasmon resonance)- это явление поверхностного возбуждения плазмонов посредством света. Поверхностный плазмонный резонанс (ППР) является важным свойством металлических наноструктур, которые находят применение в качестве оптических сенсоров на биомолекулы, а также в области фототермической терапии, для улучшения спектрального сигнала, увеличения эффективности фотоэлектрических преобразований и проведения каталитических реакций.

37. Методы ЯМР в исследовании биомолекулярных комплексов При насыщении в стационарном режиме намагниченность системы может сильно возрасти. Это - т. наз. эффект Оверхаузера, для ядер обозначаемый NOE (Nuclear Overhauser effect), который широко применяется для повышения чувствительности, а также для оценки межъядерных расстояний при изучении мол. геометрии методами спектроскопии ЯМР. При взаимодействии белков изменяются параметры, которые возможно детектировать с помощью ЯМР: могут наблюдаться изменения химических сдвигов. Другой важный источник информации – знаки и интенсивности сигналов NOE. Коэффициенты диффузии лиганда в связанном и свободном состояниях различны, а ширины спектральных линий чувствительны к его релаксационным свойствам. Картографирование центров связывания 15N,13C-меченых белков и немеченых лигандов может осуществляться с помощью так называемой процедуры X-фильтрации.