血清成分分析

1. 血清成分分析 答辩人：黄静 指导老师：吴明江 2008/12/28

2. 实验一血清胆固醇的定量测定（邻苯二甲醛法）实验一血清胆固醇的定量测定（邻苯二甲醛法） 【实验目的】 ●了解并掌握邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇的原理和方法。

3. 【实验操作】 1、血清总胆固醇标准曲线的绘制：取洁净试管5支，按表1进行操作： 加毕，混匀，静置10min，以550nm波长比色测定，以吸光度值为纵坐标，胆固醇含量为横坐标，做标准曲线。

4. 2、样品的测定 取2支清洁干燥试管，编号后，按表2加入试剂。 加毕，混匀，静置10min，于550nm波长比色，以对照管校零点，对照标准曲线即知100mL样品中总胆固醇含量（mg）。

5. 【实验结果】 血清胆固醇含量：从图中可标准曲线可查算出样品0非免疫的血清胆固醇含量 0.97mg/mL、样品1免疫的血清胆固醇含量1.34mg/mL。

6. 【结果分析】 非免疫的兔血清胆固醇含量 0.97mg/mL比免疫的兔血清胆固醇含量1.34mg/mL要低，首先想到的是血清中免疫细胞的增生对血清总胆固醇的含量可能会存在一定的影响。 ＊查找相关理论显示：血液中胆固醇的LDL（低比重脂蛋白）被氧后，变成了恶劣的变性LDL。免疫细胞中的一种巨噬细胞能将这种变性的LDL看作是细菌等异物，不断地将之吞吃掉，故结果应该是免疫血清中的总胆固醇含量低于非免疫的。 这与我的实验结果相悖，而我认为正常动物体内总胆固醇中的LDL含量很少，免疫细胞的这种吞噬作用就不大，免疫细胞的增生影响作用就大致可以忽略，所以非免疫的兔血清胆固醇含量和免疫的兔血清胆固醇含量应该是近似相等的。 引起误差最有可能的原因有： ▲配置好的样液放置时间过久，甚至两支显色样液放置时间不一样。 ▲加混合酸后振摇过激能使产热过高，引起偶然误差。

7. 实验二血清谷丙转氨酶活力单位测定 【实验目的】 ●了解并掌握用分光光度法测定血清丙转氨酶的活力。

8. 【实验操作】 1、GPT活力单位标准曲线的绘制：

9. 2、样品的测定

10. 【实验结果】 GPT活力单位数：从图中可标准曲线可查算出样品1免疫血清中GPT活力单位数为1.19、样品0非免疫血清中GPT活力单位数为1.34。

11. 【结果分析】 非免疫GPT活力单位 为1.34较免疫血清中GPT活力单位为1.19要高。 我认为造成这种结果的原因很可能是在发生免疫反应的过程中，血清的ph可能发生了改变，使得GPT得以在一个比在没发生免疫但ph更适合的环境中发挥活性。

12. 比色法中参比液的选取 实验一对照组加入了血清，而没加显色剂邻苯二甲醛，这是由于显色剂在所测定的波长有一定的吸收，为避免造成实验误差就使用这种—试样参比。 实验二对照管直接不加血清，是因为样液的组分比较简单，与其他组分共存对所测定波长无任何吸收，故用这种—试剂参比。 参考：周先碗，胡晓倩. 生物化学仪器分析与实验技术 .化学工业出版社, 2003年第一版

13. 实验三血清清蛋白与γ-球蛋白的盐析、透析与浓缩实验三血清清蛋白与γ-球蛋白的盐析、透析与浓缩 【实验目的】 • 1. 掌握盐析法分离提纯蛋白质的原理和方法； • 2. 掌握透析法脱盐与蛋白质浓缩的方法； • 3. 掌握凝胶过滤层析的技术方法； • 4. 掌握利用醋酸纤维素薄膜电泳法分离与鉴定血清清蛋白的原理和方法。

14. 【实验操作】 1、血清清蛋白与γ-球蛋白的盐析： 蛋白质的盐析： 高浓度盐溶液，在水溶液中电离，其 正、负离子吸引水分子，从而夺取水化膜，还可以中和部分电荷。这样，就不同程度地去掉了上述的两 个稳定因素，使蛋白质凝聚、沉淀。 2、血清清蛋白的透析与浓缩：

15. 3、凝胶层析 结果：混合液在凝胶柱中分离，蓝色的蓝葡聚糖在下方，黄色的重铬酸钾在上方。用试管收集流出蓝、黄色液体，比色并画出洗脱曲线。 1-5 无色 6-10 蓝色 11-13 无色 14-30 黄色 31-32 无色 注意：装柱要均匀，不要有气泡和分层，凝胶面要平整！ 简要分析：重铬酸钾和蓝葡聚糖混合溶液通过Sephandex G-200凝胶柱时，先出来的是蓝色的蓝葡聚糖，然后是黄色的重铬酸钾，根据凝胶层析的原理易知：蓝葡聚糖的分子量大于重铬酸钾。另外，凝胶层析就是利用生物大分子的相对分子质量的差异进行层析分离，因此我们可以用淀粉或者琼脂糖作为电泳支持物分离血清中的蛋白质，而凝胶在其中就起着分子筛的作用。

16. 4、血清清蛋白与γ-球蛋白的鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳法）4、血清清蛋白与γ-球蛋白的鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳法） 醋酸纤维素素薄膜作为是电泳支持体有以下优点： ①它对各种蛋白质（包括血清白蛋白，溶菌酶及核糖核酸酶）都几乎完全不吸附，因此拖尾现象； ②通电时间较短（二十分钟至一小时）； ③对染料也没有吸附，因此不结合的染料能完全洗掉，无样品处几乎完无色。它的电渗作用虽高但很均一，不影响样品的分离效果，电泳后区带界限清晰；

17. 【实验结果】

18. 【结果分析】 醋酸纤维素薄膜电泳的实验是失败的，全蛋白电泳后只分离出两条模糊的区带，分析原因总结有一下几点： ①醋酸纤维素膜的质量不合要求 此实验对膜的要求的比较严格的：1.制膜的原料即醋酸纤维素必须具有很高的纯度，其中如有杂质则很难得到好的实验结果；2.制好的膜要质地均匀、薄厚适宜、吸水性好。但有考虑到该膜是经检验后出厂的，次品率不会如此之高，故该原因很小。还有可能是手指与膜面接触而污染了膜。 ②电泳前没有对膜进行预处理 醋酸纤维素膜对水的亲和性比较小，故电泳时要保证膜片上含有一定的缓冲液，应预先将膜片在缓冲液中浸透，避免膜过干，造成全蛋白难以分离。 ③电极缓冲液浓度过高 理论上常用pH=8.6巴比缓冲液的浓度介于0.05mol/l—0.09mol/l 之间。实际上所用的缓冲液浓度略高，造成区带移动速度减缓， 进一步导致分离区带过于集中不易辨认。另外，在醋酸纤维素 膜电泳实验中，电流大部分都是由样品传导的，因此会产生很 多的热，即使选择的缓冲液的浓度适宜，在环境温度升高或使 用较高电压的情况下，水分的热蒸发加剧，也可造成缓冲液的 浓度过高。 ④加样量过多 ⑤氨基黑10B染色剂浓度过高，给背景的脱色带来困难

19. 实验四谷丙转氨酶活性的鉴定（纸层析法） 【实验目的】 ●掌握用纸层折法观察肝脏丙转氨酶ALT的转氨作用。

20. 【实验结果及分析】 结合GPT纸层析法结果图，得出结论：测试管（加入谷丙转氨酶）层析出2条带，记为带1、带2（D带1>D带2），对照管（酶已失活）与标准谷氨酸和带1所层析出的距离是一样的，但，说明样液中谷氨酸的含量减少了；带2与标准丙氨酸层析出来的结果也大致相同，颜色也较之明显浅了很多。这就验证了从肝脏中提取的谷丙转氨酶可以催化谷氨酸减少的和产物丙氨酸的生成的这一氨基移换反应。

21. 实验收获： 此次实验是一次开放自主的革新实验，与往常所做的实验最大的不同就是教师只是粗略讲解一下原理、目的等，具体的实验操作、问题探究完全由我们自己独立思考。这样我们对于实验知识能够掌握得更加全面，更牢固；对于实验技能也是一次很好的提高机会。然而也正是因为这样我们花在实验室的时间大大增加，有时候没把握好时间就很容易影响到其他学习。同时，我也深刻地体会到科研的艰辛，对于大四毕业论文也有了一定的心理准备。 • 致谢： 本学期的生化实验已经结束了，在这里忠心地感谢吴明江老师的精心指导。

22. Thank you ! Time’s up