. . . و خدایی که در این نزدیکی است.

1. ... وخدایی که در این نزدیکی است. . . . و خدایی که در این نزدیکی است.

2. الکتروفورز مولکولهای بیولوژیکی سارا حسن پور بهار 87

3. الكترو فورز چيست؟ روشي براي جداسازي و مطالعه مولكولهاي بيو لوژيكي پروتئين اسيد هاي نوكلئيك قند ها نمونه هايي که بار الکتريکي دارند، تحت تأثير يك ميدان الكتريكي از ميان شبکه اي متخلخل حركت مي کنند و از يکديگر جدا مي شوند.

4. تاريخچه • اولين تجارب در جداسازي ماكرومولكولها توسط الکتروفورز دوبعدي به کارهاي Smithies  و Poulik در سال 1956 باز مي گردد • جداسازي پروتئين هاي سرم • دهه 40 و 50 نقطه ي عطف در توسعة الكتروفورز • الكتروفورز ژل پلي آكريل آميد به همراه سديم دو دسيل سولفات در سال1970

5. زمينه هاي كاربردي تعيين جرم مولكولي نسبي (Mr) مشخص كردن غلظت پروتئين شناسايي تغييرات پروتئينو DNA تعيين نقشه پپتيدي و...

7. فاكتورهاي مهم ميزان بار الكتريكي نمونه وزن نمونه اندازه و شكل نمونه ميزان ولتاژ و جريان اعمالي نوع ژل و ميزان تخلخل آن نحوه آماده سازي نمونه نحوه رنگ اميزي عوامل محيطي

8. اثر حرارت • براي حفظ تکرار پذيري, ثابت نگاه داشتن حرارت در تمام مراحل الکتروفورز بسيار مهم است • انتقال گرما باعث بروز بي نظمي در اندازه ي منافذ ژل • شکستن شيشه هاي الکتروفورز, حرارت ايجاد شده بر اثر مقاومتي است که الکترودها, بافر مورد استفاده, و ژل دارند و به گرماي ژول Joule heat موسوم است.

9. اثر سيستم هاي بافري و pH پروتئين ها به علت خصوصيت آمفوتري خود تحت تاثير pH  محيطي که در آن قرار داشته باشند بارالکتريکي خاص خود را نشان مي دهند

10. منبع الکتريکي انتخاب نوع پارامتر ثابت در منبع الکتريکي در حين الکتروفورز, مدت زمان مورد نظر براي انجام الکتروفورز, الزام به حداقل رساندن انتشار نمونه مقدار از دست دادن فعاليت نمونه که بر اثر حرارت و در طول زمان رخ مي دهد, نياز به حفظ دماي خاص براي انجام الکتروفورز

11. نمونه هاي لود شونده انواع نمونه ها نمونه هاي محلول نمونه هاي بافتي نمونه هاي سلولي سلولهايي كه در محيط آزمايشگاه به صورت سوسپانسيون رشد داده سلولهايي كه در محيط هاي جامد كشت داده مي شوند يک مشکل خاص در آناليز نمونه هاي بافتي ماهيت ناهمگون اين نمونه ها است

12. آماده سازي نمونه اولين قدم ليز سلولها و خارج ساختن محتواي پروتئيني آنهاست روشهاي متفاوت  مکانيکي و شيميايي درليز و متلاشي ساختن سلولها به کار گرفته مي شود خارج ساختن موادي نظير نمكها، ليپيدها، پلي ساكاريدها، و اسيدهاي نوكلئيك افزودن بافرهاي محلول سازي و کائوتروپيک, دترجنت, معرف احيا کننده, و آمفولايتها پروتئينهاي نمونه بايد درحين روند الكتروفورز دوبعدي محلول باقي بمانند

13. معرفهاي کائوتروپيک ساده تر کردن نمايه دو بعدي و حذف اثر شکل فضايي Denaturing جذب گروه هاي آب دوست (Hydrophill) و قطبي در سطح پروتئين ها گروه هاي آب گريز در سطوح داخلي پروتئين در معرض محيطخارجي ورود آب و اوره به محيط داخلي پروتئين سبب ايجاد بي ثباتي و برهم زدن شکل طبيعي پروتئين مي شود.

14. دترجنت ها دترجنت ها مولکولهاي Amphipathic هستند پيوند هيدروژنيگروه هاي قطبي با مولکولهاي آب تشكيل Micelle دترجنت ها در محلول ساختن پروتئين هاي غشايي مانند محيط دو لايه ي ليپيدي غشا هاي بيولوژيک عمل مي کنند در بافر محلول سازي, دترجنت ها تقويت کننده ي اثر معرف هاي کائوتروپيک هستند

16. عوامل احيا کننده شکستن پيوندهاي دي سولفيدي داخل- و بين مولکولي براي پروتئينهاي منفک شده از سلولهاي اوکاريوتي كاربرددارد با الكتروفورز در شرايط احيا شده و يا بدون شرايط احياء مي‌ توان اطلاعاتي راجع به ساختار پروتئين بدست آورد

17. حامل هاي آمفولايتي به حداقل رساندن پديده ي توده شدن پروتئين ها براي جبران از دست رفتن نمک درنمونه هاي پروتئيني که براي حفظ حلاليتشاننياز به وجود نمك دارند

18. روشهای مختلفی برای الکتروفورز وجود دارد الكتروفورز در بعد اول پروتئين ها بر اساس بار الکتريکي, که يک خصوصيت ذاتي و وابسته به ساختار اسيد آمينه هايشان است, از يکديگر جدا مي شوند الكتروفورز در دو بعد جداسازي بر اساس بار الكتريكي و وزن مولكولي

19. مراحل مختلفدرفرايند الكتروفورز اماده سازي نمونه و ژل لود كردن نمونه رنگ آميزي ژل در روشهاي مختلف الكتروفورز يك سري تفاوتهاي جزئي وجود دارد.

20. ژل متخلخل الک غربال کننده بر اساس اندازه مولکول ژل مابين دو محفظه ي بافري قرار مي گيرد به طوريکه ژل تنها واسطه در عبور جريان الکتريسيته بين اين دو محفظه باشد ممانعت از انتشار مولکولها در اثر گرماي ايجاد شده

21. ژل متخلخل براي درست کردن ژل دو انتخاب وجود دارد continuous system يک غلطت و يک نوع بافر و pH در کل پروسه discontinuous system تفاوتقسمت هاي مختلف پروسه از نظر غلظت و بافر و pH براي DNA يک نوع ژل (معمولا با غلظت کم) درست ميکنيم وبراي پروتئين (معمولا) دو نوع

22. انواع ژل ژل اگارز آگارز مخلوطي از دو پلي‌ساكاريد آگارز و آگاروپكتين است كه از بعضي از انواع گونه‌هاي جلبك دريايي بدست مي‌آيد جداسازيپروتئين‌ هاي بسيار بزرگ ژل پلي اكريلاميد پليمريزاسيون مونومرهاي اكريل آميد و بيس آكريل آميد جداسازي پروتئين‌ ها و پلي‌ نوكلئوتيدهاي با طول 5 تا 2000 جفت باز

24. پلي اكريلاميد نسبت به ژل هاي آگارز كندتر صورت مي گيرد. چون اكسيژن آزاد از فرآيندپليمريزه شدن ممانعت به عمل مي آورد  ژل هاي پلي اكريلاميد طيف كوچكي از جداسازي البته با قدرت تجزيه بالا را دارا مي باشند ژل هاي آگارز طيف بزرگي از جداسازي را البته با قدرت تجزيه نسبتا پايين دارا مي باشند

25. اندازة منافذ ژل عامل اصلي در تعيين قدرت تفكيك پروتئين ها و پلي پپتيدها در ژلهاي پلي آكريل آميد است. اندازه ي منافذ با دو پارامتر مشخص مي شوند: محتواي کل ماده ي جامد نسبت مونومر ايجاد کننده ي پيوند متقاطع به مونومر آکريل آميد

26. با تغيير در غلظت آكريل آميد و نسبت اتصالات متقاطع کنترل اندازه ي منافذ امکان پذير است

27. با تغيير غلظت آگارز، قطعات DNA حدود 200 تا 50000 جفت بازي مي توانند با استفاده از تكنيك هاي الكتروفورزي استاندارد جدا گردند بعد

28. حرکت هر پروتئين خاص (در غلظت هاي مختلف ژل) از منحني خاص خود تبعيت ميکند (منحني فرگوسن) اگر پروتئين مورد نظر اندازه درشتي دارد بايد اندازه منافذ ژل را بزرگتر بسازيد

30. اشكال ژل در الكتروفورز لوله‌اي صفحه‌اياندازه كوچك (7×7 سانتيمتر) و استاندارد (14×16 سانتيمتر) عمودي افقي

31. ضخامت ژل اختلاف در دما بين سطح و عمق سبب ميشود پروتئين در عمق سريعتر از سطح حرکت کند با افزايش حرارت، حرکت مولکول ها بيشتر شده و پخش خودبخودي نيز رخ ميدهد

32. الکتروفورزSDS-PAGE معمول ترين روش براي جداسازي پروتئين ها است از ژل پلي آكريلاميد استفاده مي شود پروتئينها در اتصال با SDS بار منفي ميگيرند نسبت بار الکتريکي به جرم مولکولي در اين پلي پپتيدها تقريبا" نسبتي مشابه است

33. بازاي هر دو مولكول اسيدآمينه يك مولكول SDS به پلي پپتيد اتصال مي‌يابد آمونیوم پرسولفات+TEMED+SDS+مونومرها

34. ژل مورد استفاده نا پيوسته است ژل بالايي ژل متراكم كننده ژل پاييني ژل تفكيك كننده از نظر pH بافر نيز ممکن است مخزن بافر بالايي با مخزن بافر پاييني متفاوت باشد

35. شروع الکتروفورز • مجموعه ژل و قالب آماده شده را در دستگاه الکتروفورز نصب ميکنيم • نمونه قبلا آماده شده به هر چاهک منتقل ميشود • مارکرهاي وزن نيز معمولا در چاهک هاي طرفين ريخته ميشود • حوضک ها از بافر کاملا پر ميشود بعد به جريان برق دستگاه وصل ميشود • پس از تفکیک, رنگ آمیزی صورت می گیرد !

36. رنگ آمیزی • جداسازی ژل بالایی • قرار دادن ژل در محلول تثبیت کننده • قرار دادن ژل در محلولرنگ انواع مختلف رنگ آمیزی • رنگ آميزي با رنگهاي آنيونيك نظير آبی كوماسي • رنگ آميزي منفي با كاتيونهاي فلزي مثل رنگ آميزي زينك يا روي • رنگ آميزي Silver يا نقره

39. مزاياي بلوتينگ • پروتئين موجود در ژل در عمق وسطح است ومولکولهاي عمقي از دسترس سريع معرف ها دور هستند • روي غشا نيازي به فيکس کردن نيست • در بهترين شرايط فقط 90 درصد پروتئين موجود در باند روي SDS به غشا منتقل ميشود

40. آناليز تصويري بهترين روش آناليز با استفاده از کامپيوتر صورت مي پذيرد تشخیص نقاط کمرنگ مقایسه تصاوير ژل هاي متفاوت ويراستن تصاوير نرماليزه کردن تصاوير

41. سایتهای مرتبط www.iranbioteh.comold.tebyan.net www.ibb.ut.ac.ir www.irbme.ir www.geoctities.com www.rehabiran.net www.uswr.ac.ir forum.p30world.com www.parsbiology.com Medicine.tums.ac.ir www.academist.ir Dbase.irandoc.ac.ir www.medicalequipment.ir

42. لب دریا برویم تور در آب بیندازیم و بگیریم طراوت را از آب با تشکر از توجه شما