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学术任职： 中国中西医结合学会风湿病分会副主任委员 中华中医药学会风湿病分会常务委员 中华医学会风湿病分会委员 中国医师协会风湿免疫科分会常务委员 重庆市中西医结合学会风湿病专业委员会主任委员

方勇飞简介 主任医师、教授、博士研究生导师 第三军医大学西南医院中西医结合科与风湿病专科主任. 学术任职： 中国中西医结合学会风湿病分会副主任委员 中华中医药学会风湿病分会常务委员 中华医学会风湿病分会委员 中国医师协会风湿免疫科分会常务委员 重庆市中西医结合学会风湿病专业委员会主任委员 重庆市中医药学会风湿病专业委员会主任委员. 感染与类风湿关节炎. 第三军医大学西南医院 方勇飞 2013 年 8 月 25 日 东莞. 类风湿关节炎的病因.

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学术任职： 中国中西医结合学会风湿病分会副主任委员 中华中医药学会风湿病分会常务委员 中华医学会风湿病分会委员 中国医师协会风湿免疫科分会常务委员 重庆市中西医结合学会风湿病专业委员会主任委员

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  1. 方勇飞简介 主任医师、教授、博士研究生导师 第三军医大学西南医院中西医结合科与风湿病专科主任 学术任职： 中国中西医结合学会风湿病分会副主任委员 中华中医药学会风湿病分会常务委员 中华医学会风湿病分会委员 中国医师协会风湿免疫科分会常务委员 重庆市中西医结合学会风湿病专业委员会主任委员 重庆市中医药学会风湿病专业委员会主任委员

  2. 感染与类风湿关节炎 第三军医大学西南医院 方勇飞 2013年8月25日 东莞

  3. 类风湿关节炎的病因 • 类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种病因未明的系统性自身免疫病。其病理特点为慢性滑膜炎，以及由此造成的关节软骨和骨质破坏，最终导致关节畸形。 • 病因：遗传和环境因素在RA发病中均发挥重要作用，两者共同参与RA发病 • 机体内外环境中微生物感染与RA之间的相关性一直是RA病因学研究的热点

  4. RA发病:基因与环境相互作用 McInnes IBN Engl J Med 2011

  5. 遗传因素 • 类风湿关节炎患者1级亲属中患病的风险较普通人群高1.5倍。 • 同卵双胞胎中RA发病的一致率为15%-30%,异卵双胞胎的RA发病一致率仅为5% • 与类风湿关节炎发病相关的易感基因包括HLA-DR、PADI4和PTPN22等。　 • PTPN22 蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型22(protein tyrosine phosphatase nonreceptor 22，PTPN22)基因。调节淋巴细胞的激活 • PADI4 Protein-arginine deiminase type IV 精氨酸脱亚胺酶 • 精氨酸到瓜氨酸转化的酶，对自身抗原的产生起重要作用

  6. 感染因素 • 某些病毒和细菌感染可能作为始动因子，启动携带易感基因的个体发生免疫反应，进而导致类风湿关节炎的发病。 • 与类风湿关节炎发病相关的病原体包括EB病毒、细小病毒B19、流感病毒及结核分枝杆菌等

  7. 微生物与风湿热 早在1932年人们就开始研究风湿热和乙型溶血型链球菌的关系,之所以 关注二者的联系，是因为临床流行病学发现，风湿热和乙型溶血链球菌感染密切相关

  8. 微生物与反应性关节炎 反应性关节炎是微生物感染后引起的无菌性关节炎 ①非淋病性尿道炎后发病型：主要为衣原体； ②细菌性腹泻后发病型：主要为沙门菌、志贺菌等 ③链球菌感染后发病型：主要为链球菌

  9. 微生物与RA Schrijver IA,(2000). Arthritis Rheum 43:2160 • 在关节滑膜组织中发现细菌肽聚糖（图A、B）其中红色是肽聚糖成分，说明细菌细胞壁可能影响RA • 用双染法免疫组化，发现细菌的肽聚糖，箭头所示 • (图C)

  10. 牙龈卟啉单胞菌与RA McInnes IBN Engl J Med 2011

  11. 牙龈卟啉单胞菌与RA • 牙龈卟啉单胞菌Porphyromonas gingivalis，Pg是革兰氏阴性、 厌氧和无动力的不解糖杆菌 • 是牙周病尤其成人牙周炎病变区最主要的优势菌。 • 牙周炎与RA密切相关。

  12. Ann Rheum Dis 2012;0:1 –6.

  13. 牙龈卟啉单胞菌与RA • RA患者有较高的牙周炎发病率，同样牙周炎患者有较高的RA发病 (Georgiou et al., 2004) • RA和牙周炎有相同的易感基因HLA-DR4 (Katz et al., 1987; Wegner et al., 2010) • RA病人血液中发现抗Pg抗体 (Loyola-Rodriguez et al., 2010) • RA滑液中能检测Pg菌DNA (Martinez-Martinez et al., 2009)

  14. 牙龈卟啉单胞菌与RA • Pg是目前知道唯一能够表达肽基精氨酸脱亚氨酶(PAD)的菌,PAD能够瓜氨酸化蛋白，是RA重要致病因子。菌PAD酶跟人类的PAD并不完全相同，但是它的作用不可取代。(McGraw et al., 1999) (Schellekens et al., 2000) • 治疗药物：噢硝唑、克拉霉素、多西环素、米诺环素（RA治疗有效 ） 。 (Ogrendik, 2009)

  15. 肠道菌群与RA McInnes IBN Engl J Med 2011

  16. 胃肠微生物群影响RA的发生 • The gastrointestinal microbiome（微生物群系） is now recognized to influence the development of autoimmunity in articular models, and specific (and potentially tractable) clinical bacterial signatures that are associated with autoantibody-positive rheumatoid arthritis are emerging出现. McInnes IBN Engl J Med 2011

  17. Microbiome(微生物组) • “ A microbiome is the totality of microbes（微生物）, their genetic elements （要素）(genomes基因组), and environmental interactions交互作用 in a particular environment. The term ”microbiome“ was coined创立 by Joshua Lederberg, who argued that microorganisms inhabiting the human body should be included as part of the human genome, because of their influence on human physiology. 8 JUNE 2012 VOL 336 SCIENCE

  18. microbiome微生物群系是微生物、 其遗传物质 (基因组) 和在特定环境中与环境相互作用的整体。 • microbiome“微生物组”一词由Joshua Lederberg 创立 • 由于其对人体生理的影响，他们认为居住在人体的微生物群系应列为人类基因组的一部分。

  19. Microbiota(微生物丛/区）

  20. 微生物触发自身免疫？ • Characteristic oral and intestinal microbiota in rheumatoid arthritis (RA): a trigger for autoimmunity? • Scher JU, Ubeda C, Pillinger MH, eta Arthritis Rheum, 2010;62:Suppl:1390. abstract.

  21. 微生态学(microbiology) • 研究正常微生物群的结构、功能及其与宿主相互依赖和相互制约关系的科学称为微生态学。它涉及生物体与其内环境（包括微生物、生物化学和生物物理环境)相适应的问题。 • 人类医学经历了治疗医学和预防医学，正在向保健医学迈进，微生态学则是保健医学的理论和实际应用的基础学科。

  22. 肠道微生物 • 在2007年美国国立卫生研究院，就颁布了人类微生物基因组计划，来更好的研究微生物在人体中所起的作用 • 肠道内大约含有1.5kg的细菌，它们能够编码的基因有300万个，是人类编码基因的100倍 • Scher JU (2011) Nat Rev Rheumatol 7 (10):569-578

  23. 肠道微生物与RA • RA患者粪便中的产气荚膜梭菌含量显著多于正常组，并且与RA病情活动度相关 SHINEBAUM R Br （1987）J Rheumatol, 26(5): 329-333 • 在RA患者滑膜中分离出耶尔森菌属等细菌的抗体 Stahlberg TH (1989) . Ann Rheum Dis 48 (7):577-581

  24. 肠道微生物与关节炎 人体肠道细菌细胞壁能够诱发实验动物产生关节炎 Chen T. (2002). Clin Exp Rheumatol 20 (2):193-200 体外研究发现，肠道菌细胞壁的肽聚糖能够激发细胞因子的释放，细菌的细胞壁成分能够激发RF的分泌 Newkirk MM .(2002) .Clin Immunol 104 (1):1-13.

  25. 肠道微生物与RA • 但迄今为止还未能找到引起RA发病的直接致病菌。与某种单一微生物感染相比，总微生物负荷量和微生态平衡是影响RA发病更重要的因素 • 芬兰风湿病学家发现早期RA患者（病程≤6个月）粪便中双歧杆菌、拟杆菌属、脆弱类杆菌亚群、直肠真杆菌-球形梭菌亚群等含量明显少于对照组，提示肠道菌群失调参与了RA的发病 • Vaahtovuo J .(2008). J Rheumatol. 35(8): 1500-5.

  26. 肠道菌群与RA相关性的中医思考 《素问.至真要大论篇》 • 诸湿肿满，皆属于脾； • 诸痉项强，皆属于湿； • 《灵素节注类编》 “痉者，经脉强急，不得屈伸，湿闭气血，不得流通，故皆属于湿也。”

  27. 研究病原微生物方法 科赫法则通常是用来确定侵染性病害病原物的操作程序法则 • 在每一病例中都出现相同的微生物，且在健康者体内不存在 • 要从寄主分离出这样的微生物并在培养基中纯培养 • 用这种纯培养的微生物接种健康而敏感的寄主，同样的疾病会重复发生 • 从试验发病的寄主中能再度分离培养出这种微生物来

  28. 脾虚湿困型类风湿关节炎患者肠道正常菌群分析脾虚湿困型类风湿关节炎患者肠道正常菌群分析

  29. 活菌培养计数 30例脾虚RA患者和21例健康人粪便菌群培养结果

  30. 注 ** ： p<0.01 • 我们通过活菌培养发现RA患者脆弱类杆菌和双歧杆菌数量显著少于健康受试者(p<0.01)。

  31. 早期类风湿关节炎患者肠道益生菌乳杆菌群落分析早期类风湿关节炎患者肠道益生菌乳杆菌群落分析

  32. 科赫法则认为病原微生物必须是可培养的活菌，但是人体内80%的菌是无法培养的科赫法则认为病原微生物必须是可培养的活菌，但是人体内80%的菌是无法培养的 • 现代DNA测序技术为研究不可培养的微生物提供了技术支持。

  33. 16S rRNA基因检测技术 • 16s rRNA基因：是细菌染色体上与rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中 • 16s rRNA具有高度的保守性和特异性，随着PCR技术的出现及核酸研究技术的不断完善，16s rRNA基因检测技术已成为病原菌检测和鉴定的一种强有力工具 • Weisburg, W. G J. (1991) Bacteriol. 173, 697–703

  34. 具体步骤 • 提取肠道细菌总DNA， 设计通用引物， 扩增所有细菌的16S rRNA 片段，电泳时不同序列在凝胶上所处位置不同，横向分析图谱，相同水平位置条带代表同一种属细菌， 比较各泳道同水平位置变化能够揭示此种属菌在各样本中组成的变化 • 优点：可以发现不可培养的菌。

  35. RA患者肠道菌群构成的差异 对电泳图谱条带数及亮度信息进行数值化， 根据肠道菌群相似性聚类分析

  36. 构成差异研究方法与结果 结果：样本可以聚合为两类， RA 患者聚合为一类; 多数健康人样本也能聚合为一类

  37. RA与对照组乳杆菌差异 条带1唾液乳杆菌, 条带2惰性乳杆菌, 条带3瘤胃乳杆菌

  38. RA与对照组乳杆菌差异 • 唾液乳杆菌 、惰性乳杆菌、瘤胃乳杆菌在RA患者中检出率是增高的；在健康志愿者图谱中未观测到黏膜乳杆菌 • 乳杆菌增加可能是RA疾病发展的结果，RA患者肠道乳杆菌反应性的增加，乳杆菌数量增加、肠道定植增多，有利于形成更厚的黏膜屏障防止致病菌侵袭

  39. 早期类风湿关节炎患者肠道梭菌对II型胶原诱导性关节炎模型的影响早期类风湿关节炎患者肠道梭菌对II型胶原诱导性关节炎模型的影响

  40. 文献报道梭菌对RA发病有重要作用，为验证条件致病细菌能否加重RA疾病病情，我们分离RA患者肠道梭菌，灌肠接种到DBA/1小鼠体内，文献报道梭菌对RA发病有重要作用，为验证条件致病细菌能否加重RA疾病病情，我们分离RA患者肠道梭菌，灌肠接种到DBA/1小鼠体内， • 2周后进行II型胶原免疫诱导关节炎，观察DBA/1小鼠在胶原诱导后关节炎发病情况。

  41. 胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型，该模型优点是与RA临床表现类似，是研究RA发病机制，以及药物疗效的重要模型。 • 图示为本实验中DBA/1小鼠肿胀关节

  42. 实验分组 • II型胶原诱导组 • II胶原诱导并且接种梭菌组 • 无胶原诱导，但接种梭菌组 • 空白对照组

  43. 评分标准 • 初次注射II型胶原后，记录小鼠关节评分3次/周。 • 参考. Nat Protoc, 2007. 2(5): p. 1269-75. • 0分：无红斑、肿胀 • 1分：跗骨或者踝关节，单一部位的轻微红斑、肿胀 • 2 分：踝关节延伸至跗骨的轻度红斑、肿胀 • 3 分：踝关节蔓延至跖骨的中度红斑、肿胀 • 4 分：踝关节蔓延至跖骨的严重红斑、肿胀，关节僵直、畸形

  44. 图a表示后肢关节评分4分，图b表示后肢关节评分3分图a表示后肢关节评分4分，图b表示后肢关节评分3分 • 图c表示后肢关节评分2分，图d表示前肢关节评分4分 • 图e表示前指关节评分3分

  45. 关节炎发病率 • 发病率：患病小鼠占总体小鼠比例，分析组间整体发病差异 • 仅II型胶原诱导模型组DBA/1小鼠，关节炎发病率100%(6/6)。 II胶原诱导且接种梭菌模型组DBA/1小鼠，发病率83%(5/6)，两组发病率无显著差异（P=0.296>0.05），发病起始时间为第30.66±8.91天迟于仅II型胶原诱导模型组第28.33±14.55天，但两组差异无统计学意义（P=0.745>0.05）

  46. 左图：每组中每只小鼠肿胀的肢体数目 右图：每组中每只小鼠肿胀关节的评分 统计分析发现在初次免疫后第13周，仅胶原诱导组小鼠关节评分3.74±0.39，患病肢体数2.67±1.03；均低于胶原诱导且接种梭菌模型组小鼠关节评分3.93±0.15（P=0.315>0.05），患病肢体数3.00±0.70(P=0.557>0.05)，差异无统计学意义。

  47. 病理切片 A：对照组小鼠关节切片 B：接种梭菌且胶原诱导组小鼠关节切片 C：组仅胶原诱导组小鼠关节切片 D：接种梭菌且胶原诱导组小鼠皮下切片

  48. 炎性细胞因子的差异 附注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与仅胶原诱导组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

  49. 附注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与仅胶原诱导组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01。附注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与仅胶原诱导组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01。 ELISA 检测发现，在初次免疫后第13周，胶原诱导且接种梭菌模型组血清中TNF-α、IL-1β含量显著高于胶原诱导模型组（P<0.05）。

  50. II型胶原诱导且接种梭菌组IL-23含量105.7±7.3 ， • 仅胶原诱导组IL-23含量95.6±8.2 • 均显著高于空白对照组64.0±4.1（P <0.01）。

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