第十三章 精液斑检验

1. 第十三章　精液斑检验

2. 第一节　概述 • 一、精液与精液斑的特点 • (一)精液的特点 • 精液主要由精子(spermatozoa)及精浆(seminal plasma)组成，是一种含蛋白质、各种酶及果糖等多种成分的碱性乳白色胶状液体。

3. 除精子外，还有睾丸细胞、白细胞、脱落柱状上皮细胞等有形成分。除精子外，还有睾丸细胞、白细胞、脱落柱状上皮细胞等有形成分。 • 精浆是由男性各附属性腺分泌物所组成，其中精囊液约占50％～80％、前列腺液占15％～30％、尿道球腺液、尿道旁腺液约占5％。 • 精囊液呈碱性，含有两种主要成分：果糖和凝固酶。前列腺液呈透明的酸性液体，含有高浓度的酸性磷酸酶，纤溶酶和中性蛋白酶。

4. 精液中蛋白可分为两类，一类是与人血清共有的蛋白成分，如白蛋白、α1-酸性糖蛋白、型特异性成分、转铁蛋白、IgA、IgG、 α1-糖蛋白、纤维蛋白原、胰岛素等。另一类是精浆中特有的蛋白成分，如前列腺特异性抗原(p30)、β-微精蛋白、 β-精浆蛋白以及α2-精浆糖蛋白等。

5. 精液中含有多种酶类，某些酶的活性水平很高，如酸性磷酸酶、磷酸葡糖变位酶、γ-谷氨酰转肽酶、乳酸脱氢酶、黄递酶、乙二醛酶、酯酶、碱性磷酸酶、纤溶酶、透明质酸酶、淀粉酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶以及凝固酶等。精液中含有多种酶类，某些酶的活性水平很高，如酸性磷酸酶、磷酸葡糖变位酶、γ-谷氨酰转肽酶、乳酸脱氢酶、黄递酶、乙二醛酶、酯酶、碱性磷酸酶、纤溶酶、透明质酸酶、淀粉酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶以及凝固酶等。 • 精液还含有精胺，精胺被精液中的二胺氧化酶氧化，即产生精液的特殊气味。

6. 精液为乳白色半透明的粘稠液体，长期未排精时可稍呈黄色。有特殊的麝香或樱粟花气味，呈弱碱性pH7.2～8.6，平均7.8，比重1.021～1.040，渗透压0.55～0.58。精液为乳白色半透明的粘稠液体，长期未排精时可稍呈黄色。有特殊的麝香或樱粟花气味，呈弱碱性pH7.2～8.6，平均7.8，比重1.021～1.040，渗透压0.55～0.58。 • 射精后的体外精液接触空气，由于受精囊腺分泌的凝固酶的作用，约5min内凝结成胶冻状。继而在中性蛋白酶及纤溶酶作用下，约20～30min内液化成稀薄半流动体状。

7. (二)精子形态特点 • 正常精子分头、尾两部分，长约60μm，外形似蝌蚪。头部长3～5μm，宽2～3μm，厚l～2μm，正面观呈卵圆形，侧面观呈梨形，主要由顶体和致密的精子细胞核组成。 • 空泡状顶体覆盖了精子细胞核的前2／3，内含多种水解酶，如顶体蛋白酶、透明质酸酶、酸性磷酸酶等，在受精时有利于精子穿透卵子外周的放射冠与透明带而进人卵内。

16. 关于精子的有趣数据： • 1. 精子产生于睾丸中，精子需要大约10周的时间达到成熟。 • 2. 成熟的精子储存在附睾中。 • 3.精子是体内最小的细胞，它需要均衡的能力补充。 • 4.必须在低于体温3-5度的温度下，才能产生大量健康的精子。 • 5.一个成年男性每天可产生7000万-1.5亿个精子。

17. 6.在勃起的阳物尖端大约有300万个精子。 • 7.射精过程中精子的运动速度可达28英里/时。 • 8.附睾中的精子通过输精管传输，输精管中有富含果糖的流体，果糖相当于 火箭的燃料，有助于精子的运输。 • 9.它每小时游12英寸。 • 10.精液中的大部分是碱性物质，它有助于精子的旅程。

18. (三)精液斑的特点 • 精斑多附着于犯罪嫌疑人或被害人的衣、裤上，女性的外阴部或大腿内侧，现场的被褥、毛巾、纸张、草席、床板、沙石、泥土等。此外，阴道擦拭物也是常见的精斑检材。

19. 精斑无固定的形态，外观常因附着物不同而有差异。精斑无固定的形态，外观常因附着物不同而有差异。 • 在体表，精斑常呈白色鳞片状痂片。在深色纺织品上，浓厚精斑呈灰白色浆糊状斑迹，偶可见结痂；较稀薄的精斑浸润于布纤维间，则不易察见。在浅色纺织品上，精斑多呈黄白色地图状，边缘色深。在软质载体，如衣、裤、纸张上的精斑手触之有硬感。 • 新鲜精斑有特殊腥气味。

20. 二、精斑检验的目的与要求 • 精斑检验的主要目的与其他物证检验一样，是为案件的侦查提供线索，为分析、审理案件提供证据。对疑为精斑的检材需要解决下列问题：可疑斑痕是否为精斑?若是精斑，确定精斑的个体来源。检验步骤为：肉眼观察、预试验、确证试验、认定为人精斑后测定遗传标记，进行个体识别。

21. 第二节　精斑的肉眼检查 • 典型的精斑呈不规则地图状。观察并记录斑迹的分布情况、数目、位置、形状、大小、颜色及光泽等。新鲜精斑触之有干浆糊斑状的硬感，有特殊的腥味。水洗、雨淋后的，或有色基质上的精斑肉眼比较难观察。可将检材置于紫外光下于暗处观察。

22. 第三节　精斑的预试验 • 一、酸性磷酸酶检验 • 精液的主要成分前列腺分泌液中含有大量酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)，较其他体液、分泌液及脏器的含量高100倍以上。该试验只能作为精斑的预试验。由于酸性磷酸酶来源于前列腺，无精子的精液ACP试验也呈阳性结果。

23. 精斑中酸性磷酸酶相当稳定，对腐败及高热有较强的抵抗力。精斑中酸性磷酸酶相当稳定，对腐败及高热有较强的抵抗力。 • 保存10余年的陈旧精斑，夏日室温放置8周的腐败精液及125℃加热30min的精液仍能检出其酶活性。 • 200 ℃加热5min则破坏ACP酶活性。

24. (一)磷酸苯二钠试验(Kind-King试法) • 1．原理精液中的酸性磷酸酶可分解磷酸苯二钠，产生萘酚，后者经铁氰化钾作用并与氨基安替比林结合，生成红色醌类化合物。 • 2．试剂 由反应缓冲液和显色液两部分组成。

25. 3．方法 　取可疑斑痕0.1cm×0.1cm，最好取斑痕边缘部位，置试管内，加缓冲液3～4滴，经37~C温箱内5～l0min后，加等量显色液，立即出现红色为阳性反应，表明检材可能是精斑。颜色深浅与酸性磷酸酶浓度呈正比，浓度愈高，颜色愈深红，浓度过高可出现红色沉淀。呈橙黄色为阴性反应，表明检材不是精斑或精斑中的酸性磷酸酶被破坏。同时剪取无斑痕处检材及已知精斑作阴性与阳性对照。

26. 磷酸苯二钠试验灵敏度较高，稀释20 000倍的精液仍呈阳性反应。被水洗过的淡薄精斑，只要适当延长缓冲液温浸时间可呈阳性结果。精液如混有血液并不影响检验，血痕在该试验中呈灰褐色。由于该试验灵敏度很高，所以操作时，一般按空白部位、可疑精斑、已知精斑的顺序剪取检材，避免污染。

27. 酸性磷酸酶试验的特异性较差，1g内脏组织如肺、肝、肾、心、胃等，用5ml缓冲液浸泡的浸液以及常见的人体分泌物或者排泄物如鼻涕、汗、唾液、成年男性尿液等也可呈弱阳性反应。为了排除上述假阳性反应，可在显色后将液体稀释64倍或将试管再放人56℃温箱中10～20min，此时精斑仍维持红色，引起假阳性的红色消退。酸性磷酸酶试验的特异性较差，1g内脏组织如肺、肝、肾、心、胃等，用5ml缓冲液浸泡的浸液以及常见的人体分泌物或者排泄物如鼻涕、汗、唾液、成年男性尿液等也可呈弱阳性反应。为了排除上述假阳性反应，可在显色后将液体稀释64倍或将试管再放人56℃温箱中10～20min，此时精斑仍维持红色，引起假阳性的红色消退。

28. (二)α-磷酸萘酚-固蓝B试验 • 二、其他预试验 • (一)碘化碘钾结晶试验(Florence crystal test) • (二)苦味酸结晶试验(Barberio crystal test) • (三)锌检出法

29. 所有的预试验中除酸性磷酸酶检验外，其他各项试验灵敏度均不高，因此精斑检验和血痕检验不同。所有的预试验中除酸性磷酸酶检验外，其他各项试验灵敏度均不高，因此精斑检验和血痕检验不同。 • 实际上精斑不一定要经过预试验后才进行确证试验，可剪取肉眼可见的斑痕直接进行确证试验。 • 有时预试验阴性的检材还是要进行确证试验，偶有磷酸苯二钠试验阴性，而查见精子的报道。

30. 第四节　确证试验 • 一、精子检出法 • 检出精子是认定精斑最简便、最可靠的方法。 • 精子具有典型而稳定的形态，不易受其他因素影响而改变。在显微镜下观察到典型精子，即能确证人精斑。

31. 精斑中的精子形态相当稳定，十余年的陈旧精斑也可能查见精子。精斑中的精子形态相当稳定，十余年的陈旧精斑也可能查见精子。 • 镜下观察精子是无色的，一般情况下精子头部有折光，尾部很细。 • 检材浸泡后涂片观察，常见精子头部和尾分离。 • 只要检见典型的精子头，也可以确证精斑。

32. 1．检材处理 • 取可疑精斑检材1.5cm×1.5cm，剪碎，置试管内，加约0.5ml生理盐水，室温2h，可用玻棒搅拌和压挤检材。然后置4℃过夜，吸出全部浸液置另一试管内，2 500r／ rain离心5min，上清液留作抗人精液沉淀反应和中和试验。 • 沉淀物涂片，干燥后甲醇固定5min，染色，检验精子。

33. 2．染色方法 • (1)单染法 • ①藻红染色法 • ②亚甲蓝染色法 • (2)复染法 • ①苏木素伊红(HE)染色法 • ②酸性品红亚甲蓝(Baecchi)染色法

34. 精斑陈旧、取材部位不准或遇到少精子症者，涂片上往往仅见少量精子，只要找到一个完整的典型精子，即能确证人精斑。精斑陈旧、取材部位不准或遇到少精子症者，涂片上往往仅见少量精子，只要找到一个完整的典型精子，即能确证人精斑。 • 精斑在浸渍处理过程中，精子尾部断落，常只检见精子头部，应与阴道滴虫、酵母菌等鉴别。典型的精子头部呈椭圆形，着色特殊，其他植物细胞、细菌、阴道滴虫等则多呈圆形，染色均匀一致。若发现几个典型的精子头部也可确证为精斑。

35. 性交后精子可以存活一段时间，一般情况下阴道内3～8h，宫颈2～5天，子宫、输卵管内l～10天的拭子内容物涂片可检见活精子。阴道内3～9天，宫颈17天的内容物涂片可检见死精子。精子的检出期限与被害人的体位、活动情况以及月经周期有关。被害人处于月经期前后或被强奸后就行走，精子检出期限短。 性交后精子可以存活一段时间，一般情况下阴道内3～8h，宫颈2～5天，子宫、输卵管内l～10天的拭子内容物涂片可检见活精子。阴道内3～9天，宫颈17天的内容物涂片可检见死精子。精子的检出期限与被害人的体位、活动情况以及月经周期有关。被害人处于月经期前后或被强奸后就行走，精子检出期限短。

36. 取阴道拭子的时间越早越好。 • 在24h后取材阴道拭子，检出率下降50％。 • 48h取材，阳性率仅10％。 • 活体阴道拭子，精子检出期限一般1.5～2天。 • 尸体处于仰卧位，则检出期限较长，最长的检出期限可达3周。 • 而冰冻两个半月的尸体，宫颈涂片偶能检出精子。

37. 二、免疫学试验 • （一)抗人精液血清沉淀反应 • 抗人精液沉淀素血清，是用人的精液作免疫原制备而成。 • 抗人精液血清沉淀反应对无精子的精斑更具价值，例如强阳性反应的新鲜精斑，显微镜下检查不见精子，可认为精斑系无精子者或输精管已结扎者所遗留。

38. 原理　用特异性抗人精液血清与可疑精斑检材浸液作沉淀反应，出现白色沉淀线为阳性反应，证明检材含有人精液。原理　用特异性抗人精液血清与可疑精斑检材浸液作沉淀反应，出现白色沉淀线为阳性反应，证明检材含有人精液。 • 方法　抗人精液血清与精斑生理盐水浸出液作环状沉淀反应、琼脂双向扩散试验或对流免疫电泳均可用于精斑种属鉴定，阳性反应表明待测斑迹是人精斑，阴性反应表明不是人精斑或精斑已遭破坏。试验时，用已知人精斑作阳性对照，检材无精斑部位作阴性对照。

39. （二)前列腺特异性抗原p30的检测 • 前列腺特异性抗原又称γ-精浆蛋白，由人类前列腺上皮细胞所分泌，是成年男子精浆中特有的一类糖蛋白，PH约6.9，分子量30 000，故名p30。 • 人精液p30正常含量为0.24～5.5mg／ml，平均为1.92mg／ml。

40. p30性质稳定。 • 22℃保存5年的精斑仍能检出。 • 在精液和精液与其他分泌液的混合斑中能存在很长时间，性交后8～13h提取的阴道拭子中仍能检出。 • p30是确证精斑的理想标记。

41. 从精液中分离纯化p30抗原，免疫动物，获得抗-p30血清。抗-p30血清具有高度的种属特异性和前列腺器官特异性，与其他人体液、分泌液、组织器官浸液及各种动物精液和血清不发生交叉反应。从精液中分离纯化p30抗原，免疫动物，获得抗-p30血清。抗-p30血清具有高度的种属特异性和前列腺器官特异性，与其他人体液、分泌液、组织器官浸液及各种动物精液和血清不发生交叉反应。 • 抗-p30血清确证精斑，灵敏度和准确性均高于精子检出法，不受精液中有无精子的影响，也不受阴道液和唾液的干扰，能正确区别人类精斑与动物精斑，是目前确证人类精斑的常用试剂。

42. 常用的方法有： • 琼脂双向扩散试验 • 对流免疫电泳 • 酶联免疫吸附试验 • 胶体金检测法等。 • p30检测的灵敏度与检测方法有关。 • 琼脂双向扩散试验能够检出200倍稀释精液，相当于10μg／m1浓度的p30蛋白。

43. 三、其他确证方法 • 生物化学方法检测特征性酶来确证精斑。 • 微量元素检测法。 • 用抗人精子单克隆抗体作酶标抗体免疫组化法。

44. 第五节　个人识别 • 一、精斑的ABO血型测定 • ABH血型物质以水溶性形式存在于人的体液、分泌液中，属糖蛋白。 • 分泌型人精液中 ABH血型物质与唾液中含量相似，常用中和试验检测。 • 非分泌型精液由于ABH血型物质含量少，需用灵敏的ELISA法检测。

45. 精斑检材中可溶性血型抗原与相应的抗体结合，使抗体的效价下降或消失，凝集红细胞的能力下降或消失。用已知型别指示红细胞检测中和后的抗体效价，凝集能力下降或消失，红细胞不凝集为试验阳性，说明精斑检材具有相应的血型抗原。精斑检材中可溶性血型抗原与相应的抗体结合，使抗体的效价下降或消失，凝集红细胞的能力下降或消失。用已知型别指示红细胞检测中和后的抗体效价，凝集能力下降或消失，红细胞不凝集为试验阳性，说明精斑检材具有相应的血型抗原。

46. 中和试验方法： • 1．抗血清效价标定 　　取12凹白瓷板一块，以2滴抗血清加2滴生理盐水作2～4倍数系列稀释，直至1／2 048。笫12凹为空白盐水对照。向每凹加入1滴2％指示红细胞悬液，摇匀，室温置30min，观察结果。能使红细胞凝集的抗体最高稀释倍数即为该抗血清的效价。若抗血清的效价为128时，要将之标化为4，应该稀释32倍。

47. 2．中和试验 • 取精斑0.5cm2，剪碎置小试管内，加0.5ml生理盐水，搅拌后室温下2h，4℃箱中过夜。 • 取精斑浸出液，在白瓷板内分三列用生理盐水作倍量稀释，稀释度由 l／2至1／128。于三列稀释液中分别加入等体积的，效价为4的抗-A、抗-B抗体及抗-H试剂，摇匀，室温下中和30min。再加入2％指示红细胞悬液各1滴，摇匀后静置30min，观察红细胞凝集情况。

48. 2．中和试验 • 以已知ABO血型的分泌型人唾液作阳性对照，以检材无斑痕部分作阴性对照。 • 在已知正确的情况下，精斑检材与无精斑检材的抑制凝集相差3级以上，证明精斑中含有相应的血型物质，综合抗-A、抗-B及抗-H中和的结果，判断精斑的 ABO血型

50. (二)酶标抗体免疫测定法 • 精斑的ABO血型测定常用直接斑点ELISA法、间接斑点ELISA法及斑点ELISA双抗夹心法，尤以直接斑点ELISA法操作简单，常作为首选方法。 • (三)DNA分型 • 用PCR-直接测序法分析ABO基因序列，可区分为4种基因：A、B、OA和OG，10种基因型。