431 likes | 810 Views
Komórki dendrytyczne – subpopulacje i oznaczanie za pomoca cytometrii przepływowej. dr n. med. Jacek Tabarkiewicz (tabar@mp.pl). KOMÓRKI DENDRYTYCZNE. Profesjonalne komórki prezentujące antygen, rozmieszczone w większości tkanek organizmu.
E N D
Komórki dendrytyczne – subpopulacje i oznaczanie za pomoca cytometrii przepływowej dr n. med. Jacek Tabarkiewicz (tabar@mp.pl)
KOMÓRKI DENDRYTYCZNE Profesjonalne komórki prezentujące antygen, rozmieszczone w większości tkanek organizmu Odkryte w 1868 r. przez Langerhansa na podstawie reakcji z solami złota Scharakteryzowane na podstawie kształtu, lokalizacji, panelu antygenów powierzchniowych oraz cech funkcjonalnych, Zaangażowane w większość oddziaływań miedzykomórkowych • rozpoczynają odpowiedź komórkową, stymulując limfocyty T pomocnicze i cytotoksyczne • pobudzają odpowiedź humoralną i produkcję przeciwciał • wspomagają funkcję komórek odporności nieswoistej • zapewniają tolerancję immunologiczną
SZPIK KOSTNY PREKURSORY KRĄŻENIEKREW PREKURSORY - NIEDOJRZAŁE MIELO- I LIMFOIDALNE DCs NIEDOJRZAŁE DCs - „wartownicy spokoju immunologicznego” TKANKI NACZYNIA LIMFATYCZNE DOPROWADZAJĄCE DOJRZEWAJĄCE DCs po kontakcie z antygenem NARZĄDY LIMFATYCZNE DOJRZAŁE DCs WĘDRÓWKA KOMÓREK DENDRYTYCZNYCH W LUDZKIM ORGANIZMIE
KRĄŻENIE MIELOIDALNE DCs CMP (common mieloid progenitor) CD34, CD33, CD11c HSC (HEMATOPOETYCZNA KOMÓRKA PNIA) CLP (common lymphoid progenitor) LIMFOIDALNE DCs CD34, CD45RA, CD10, IL7R SZPIK KOSTNY
Subpopulacje a immunofenotyp komórek dendrytycznych Immunology Today Vol.21 No. 9 Sep. 2000
Subpopulacje a immunofenotyp komórek dendrytycznych TRENDS in Immunology Vol.22 No. 1 jan. 2001
ZMIANA FENOTYPU KOMÓREK DENDRYTYCZNYCH W TRAKCIE DOJRZEWANIA WELONOWATE DCs CD80 CD83 CD86 CCR7 PREKURSORY SZPIKOWE NIEDOJRZAŁE DCs FcγRI FcγRII CD68 CCR1 CCR4 CCR5 CXCR4 DOJRZAŁE DCs CD54, CD58 CD80, CD86 CD83, CD40L DC-LAMP CCR7
Metoda oznaczanie komórek dendrytycznych jako komórki Lin-/CD11c+/HLA-DR+ lub Lin-/CD123+/HLA-DR+ • Stosujemy koktajl następujących przeciwciał sprzężonych z FITC: CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD56 – które znakują nam limfocyty, monocyty, neutrofile i eozynofile – komórki Lin+
Metoda z użyciem koktajlu przeciwciał monoklonalnych • 1. Dla oznaczenia mieloidalnych DC używa się przeciwciał monoklonalnych: anty-CD14, anty-CD16 FITC, anty-CD33 PE oraz anty-HLA-DR CyChrome. Za mieloidalne komórki dendrytyczne uznaje się komórki o immunofenotypie CD14-, CD16-/CD33+, HLA-DR+. • 2. Dla oznaczenia limfoidalnych DC używa się przeciwciał monoklonalnych: anty-CD3, anty-CD11c, anty-CD14, anty-CD16, anty-CD19 FITC, anty-CD4 PE oraz anty-HLA-DR CyChrome. Za limfoidalne DC uznaje się komórki o immunofenotypie CD3-, CD11c-, CD14-, CD16-, CD19-/CD4+, HLA-DR+
Limfoidalne DC: CD3-,CD11c-,CD14-,CD16-,CD19-/CD4+,HLA-DR+ R3=0.10%
Oznaczanie krążących komórek dendrytycznych za pomocą przeciwciał anty-BDCA firmy Miltenyi Biotec Do oznaczenia komórek dendrytycznych lini mieloidalnej używa się przeciwciał anty-CD19 i anty- BDCA-1 (CD1c). Komórki o immunofenotypie CD19- i BDCA-1+ odpowiadają mieloidalnym DC. Komórki BDCA-1+ wykazujà ekspresję nastepujących antygenów: CD4+, Lin-, CD11cbright, CD123dim, CD45RO+, CD2+, CD13+, CD33+, CD32+, CD64+ oraz HLA-DR+. Stanowią średnio ok. 0,3% leukocytów krwi obwodowej.
Oznaczanie krążących komórek dendrytycznych za pomocą przeciwciał anty-BDCA firmy Miltenyi Biotec Do oznaczenia komórek dendrytycznych linii limfoidalnej/plazmacytoidalnej używa się przeciwciał anty BDCA-2 (CD303)i CD123. Limfoidalnym DC odpowiadają komórki o immunofenotypie BDCA-2+ i CD123+. Komórki BDCA-2+ wykazują ekspresję CD4+, Lin-, CD11c-, CD123bright, CD45RA+, CD2-,CD13-, CD33-, CD32-, CD64- oraz HLA-DR+ Stanowią średnio ok. 0,4% leukocytów krwi obwodowej.
Oznaczanie krążących komórek dendrytycznych za pomocą przeciwciał anty-BDCA firmy Miltenyi Biotec Do oznaczenia kolejnej subpopulacji komórek dendrytycznych linii mieloidalnej można użyć przeciwciał anty BDCA-3 i CD14 PE. Komórki te wykazują następujący immunofenotyp CD4+, Lin-, CD11c dim, CD123-, CD45RO+ and CD2-, CD13, CD33. Nie wykazują ekspresji receptorów Fc: CD32, CD64 i FcεRI. BDCA-3 może występować w niskiej ekspresji na monocytach, plazmocytoidalnych DC: BDCA-2+ BDCA-4+ i także komórkach CD1c (BDCA-1)+. Stanowią średnio ok. 0,02% leukocytów krwi obwodowej.
Oznaczanie krążących komórek dendrytycznych za pomocą przeciwciał anty-BDCA firmy Miltenyi Biotec Do oznaczenia kolejnej subpopulacji komórek dendrytycznych linii limfoidalnej można użyć przeciwciał anty BDCA-4 (CD304/Neuropilin-1) FITC i CD123 PE. Odpowiadają komórki o immunofenotypie BDCA-4+ i CD123+. Komórki BDCA-4+ wykazują immunofenotyp: CD4+, Lin-, CD11c-, CD123bright, CD45RA+, CD2-, łańcuch α pre-TCR i BDCA-2+. Ich ilość we krwi obwodowej jest zbliżona do komórek BDCA-2+ (CD303)+.
BDCA1+\CD19- i BDCA-2+\CD123+ komórki dendrytyczne – krew obwodowa
BDCA1+\CD19- i BDCA-2+\CD123+komórki dendrytyczne – zapalny płyn stawowy (MIZS)
BDCA1+\CD19- i BDCA-2+\CD123+komórki dendrytyczne – przerzutowe węzły chlonne (rak płuca)
BDCA1+\CD19- i BDCA-2+\CD123+komórki dendrytyczne – tkanka nowotworowa(rak płuca)
BDCA1+\CD19- i BDCA-2+\CD123+komórki dendrytyczne – płyn opłucnowy(rak płuca z przerzutami do opłucnej)
BDCA3+\CD14- i BDCA-4+\CD123+ komórki dendrytyczne krew obwodowa
Kliniczne zastosowanie szczepionek z DCs Nowotwór Ilość prób klinicznych Chłoniak 2 Szpiczak 9 Białaczki 8 Czerniak 21 R. piersi 12 R. jajowodu 1 R. pęcherza 1 R. pęcherza 26 R. nerki 18 Guzy z ekspresją CEA 1 R. przytarczyc 1 R. tarczycy 3 R. przełyku 1 R. żołądka 2 R. j. cienkiego 2 R. j. grubego 10 R. wątroby 4 R. płuca 7 R. trzustki 8 Nowotwory U.N. 11 R. Nosogardzieli 1 Różne 2 HIV 4 HBV 1
Wykorzystanie szczepionek z DCs w innych schorzeniach Choroby autoimmunizacyjne Infekcje wirusowe Infekcje bakteryjne Choroby pasożytnicze Choroby alergiczne
W immunoterapii używamy najczęściej komórek dendrytycznych wygenerowanych z monocytów krwi obwodowej. Do ich immunofenotypowania używamy najczęściej przeciwciał anty: CD14, CD45, CD1a, CD83, CD80, CD86, HLA-DR.
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA • W całej procedurze używamy buforu do DC składającego się z PBS (bez jonów Ca2+ i Mg2+) wzbogaconego 0,5% BSA i 2mM EDTA. • Używamy chłodnego buforu, a inkubację i płukanie przeprowadzamy w 4C
Dodajemy 20l FcR Blocking Reagent • Dodajemy 10l przeciwciał anty-BDCA-1 lub anty BDCA-2 • Zawieszamy 10x107 komórekw 80l buforu • Dodajemy odpowiednie ilości pozostałych przeciwciał • Przeprowadzamy 10 min inkubacje w 4C • Dodajemy 1-2ml buforu na każde 10x107 komórek i wirujemy przez 10 min. z przyśpieszeniem 300xg w temperaturze 4C • Zlewamy supernatant i przeprowadzamy analizę cytometryczną
Do powstania prezentacji przyczynili się: • mgr Sebastian Radej • dr n. med. Agata Surdacka • mgr Magdalena Wasiuk • mgr paulina Wdowiak • dr n. med.. Kamila Wojas-Krawczyk