实验四 蛋白质等电点测定

1. 实验四 蛋白质等电点测定 《食品生物化学实验》课件

2. 蛋白质的两性性质和等电点测定 一、实验目的 • 1、了解蛋白质是两性电解质，在酸性溶液中成阳离子，在碱性溶液中成阴离子。 • 2、掌握蛋白质在等电点（pI）时引起聚沉，加入乙醇、丙酮溶剂而使蛋白质溶液变化。

3. 2.实验原理 蛋白质是两性电解质。蛋白质分子中可解离基团除N-端α-氨基与C-端 羧基外，还有肽链上某些氨基酸残基的侧链基团，如Phe、Thr、Ser的羟基、Cys的巯基、Arg的胍基、His的咪唑基，Asn、Gln的酰胺基和Lys的ε-氨基等都能解离为带电基团。 在蛋白质溶液中存在着下列平衡： 阴离子 两性离子 阳离子 pH＞pI pH = pI pH＜pI 电场中： 移向阳极 不移动 移向阴极 调节溶液的pH使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，即所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点(pI)。 在等电点时，蛋白质溶解度最小，溶液的混浊度最大。配制不同pH的缓冲液，观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情况即可大致确定蛋白质的等电点。在pH梯度电泳中，蛋白质泳动到其相应的等电点时则停止泳动，据此可分离等电点不同的蛋白质。

4. 蛋白质的等电点 当溶液在某一 pH 值时，蛋白质所带正、负电荷相等，即总净电荷为零，此时溶液的 pH 称该蛋白质的等电点(isoelectric point)。

6. 本实验借助观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制成各种不同pH值的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。蛋白质在不同pH溶液中形成了不同的混浊度，即混浊度最大时的pH值即为该种蛋白质的等电点值，这个方法虽然不很准确，但在一般实验条件下都能进行，操作也简便。本实验借助观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制成各种不同pH值的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。蛋白质在不同pH溶液中形成了不同的混浊度，即混浊度最大时的pH值即为该种蛋白质的等电点值，这个方法虽然不很准确，但在一般实验条件下都能进行，操作也简便。

7. 三、实验步骤 1.制备蛋白质溶液 （1）称取酪蛋白0.6g，放在烧杯中，加入40℃的蒸馏水20ml 。 （2）加入10ml 1 M氢氧化钠溶液，微热搅拌直到蛋白质完全溶解为止。将溶解好的蛋白溶液转移到100ml容量瓶中，并用少量蒸馏水洗净烧杯，一并倒入容量瓶。 （3）在容量瓶中再加入1 M醋酸溶液10ml，摇匀。 （4）加入蒸馏水定容至100ml，得到略现浑浊的0.6M醋酸钠(NaAc)溶液中的酪蛋白胶体。如果出现絮状物沉淀，则需要进一步搅拌。

8. 2.等电点测定 按下表次序在各管中加入蛋白质溶液，并准确地加入蒸馏水和各种浓度的醋酸溶液（每管总量10 ml） ，加入后立即摇匀，计时观察。

9. 四、实验结果 观察各管产生的混浊并根据浑浊度来判断酪蛋白的等电点。观察时可用+，++，+++，++++，+++++表示浑浊度。说出酪蛋白质等电点pI = pH=？。

10. 五、讨论分析 1．解释蛋白质两性反应中颜色及沉淀变化的原因。 2．该方法测定蛋白质等电点的原理是什么？ 六、改进实验建议

11. 附：仪器和试剂 • 主要仪器：试管，吸管，容量瓶等。 • 0.01 M醋酸溶液，0.1 M醋酸溶液，1 M醋酸溶液 • 1 M氢氧化钠溶液（氢氧化钠和醋酸溶液的浓度要标定）

12. 仪器和试剂

13. 酪蛋白胶体

14. 实验结果