第九章基因治疗

第九章基因治疗 一、概念： • 经典的基因治疗：指正常的基因整合入细胞基因组以校正或置换致病基因的一种治疗方法。 • 广义的基因治疗：将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。

体细胞(somatic cell)基因治疗 生殖细胞(germline)基因治疗只限于某一体细胞的基因的改变只限于某个体的当代对缺陷的生殖细胞进行矫正当代及子代基因治疗分类

1973年第一例人体实验 1978年第二例基因治疗实验基因治疗动物实验广泛开展 Dr Anderson（1980）首先阐明基因治疗前景和发展方向 Rosenberg（1990）利用逆转录病毒将基因导入肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），并将TIF输回体内，TIF集中在肿瘤部位，表达neoR。

1990年9月14日：第一例正式批准的基因治疗实验开始进行（美国，世界上开展基因治疗最早的国家）大规模进行基因治疗临床实验必须经历以下阶段：体外试验和动物试验 I期临床试验——6---10名志愿者 II期临床试验——20---30名志愿者 III期临床试验——充分分析疗效、安全性中国 1991年7月开始进行基因治疗试验

一、基因治疗的策略 The Strategy of Gene Therapy

（一）基因置换（gene replacement） 定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，以导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因。目的：将缺陷基因的异常序列进行矫正。对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变。

又称为基因打靶(gene targeting） • 定点整合的条件:转导基因的载体与染色体上的DNA具有相同的序列。带有目的基因的载体就能找到同源重组的位点，进行部分基因序列的交换，使基因置换这一治疗策略得以实现。基因同源重组技术

要实现基因置换，需要采用同源重组技术使相应的正常基因定向导入受体细胞的基因缺陷部位。要实现基因置换，需要采用同源重组技术使相应的正常基因定向导入受体细胞的基因缺陷部位。 • 定向导入的发生率约1/100万，采用胚胎干细胞培养的方法，这种同源重组的检出率最高可达1/10。

基因置换必要条件： 1、对导入的基因及其产物有详尽的了解 2、外来基因能有效地导入靶细胞 3、导入基因能在靶细胞中长期稳定存在 4、导入基因能有适度水平的表达 5、基因导入的方法及所用载体对宿主细胞安全无害

（二）基因添加 基因添加或称基因增补（gene augmentation）:通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。类型: • 在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因，而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能； • 向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。

（三）基因干预 基因干预(gene interference) 指采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因而使之不表达，以达到治疗疾病的目的。 • 反义核酸：封闭基因表达 • 核酶：裂解特异的靶mRNA • RNA干涉技术：

（四）自杀基因治疗 • 自杀基因治疗:恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。 • 原理:将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。

自杀基因的作用机制

☻TK/GCV单纯疱疹病毒（herps simplex virus, HSV）Ⅰ型胸苷激酶（thymidine kinase, tk）基因编码胸苷激酶，特异性地将无毒的核苷类似物丙氧鸟苷（ganciclovir, GCV）转变成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，导致细胞死亡。 1.自杀基因系统 ☻CD/5-FC 大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase, CD）基因，在细胞内将无毒性5-氟胞嘧啶（5-FC）转变成毒性产物5-氟尿嘧啶（5-FU）。 5-氟尿嘧啶通过竞争性抑制胸苷酸合酶的活性，从而抑制脱氧胸苷三磷酸的合成。

2. 旁观者效应 旁观者效应:“自杀基因”治疗不仅使转导了“自杀基因”的肿瘤细胞在用药后被杀死，而且与其相邻的未转导“自杀基因”的肿瘤细胞也被杀死。

（五）基因免疫治疗 通过将抗癌免疫增强细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。

二、基因治疗的必要条件 • 发病机制在DNA水平上已经清楚； • 要转移的基因已经克隆分离，其表达产物有详尽的了解； • 该基因正常表达的组织可在体外进行遗传操作；

理想的基因治疗还必须： • 外源基因可有效导入靶细胞 • 外源基因能在靶细胞中长期稳定存留 • 导入基因能适量表达 • 导入基因的方法及载体对宿主细胞安全无害

二、基因转移技术 The Technique of Gene Transfer

基因治疗的两种途径 靶细胞 ex vivo 载体目的基因 in vivo

基因治疗途径 1、间接体内治疗途径（ex vivo）是先从患者体内取出某一器官组织的细胞，体外扩增后，将目的基因转入靶细胞形成表达外源基因的遗传修饰细胞，选择高表达的细胞扩增培养，以一定数量移植患者体内。（安全、易控制但操作复杂） 2、直接体内治疗途径（in vivo）将目的基因体内直接转移到靶细胞，所用载体必须具有特异的导向性和转移效率。（操作简单但疗效短、免疫排斥等）

基因转移(gene transfer)技术： 1.病毒介导的基因转移系统。 2.非病毒介导的基因转移系统。

1.病毒介导的基因转移系统 病毒载体介导的基因转移效率较高，因此它也是使用最多的基因治疗载体。据统计，有72%的临床实验计划和71%的病例使用了病毒载体，其中用得最多的是逆转录病毒载体。

（1）逆转录病毒 Retrovirus

逆转录病毒前病毒的结构特点 （1）两端各有一长末端重复序列LTR。（2）LTR由U3、R和U5三部分组成。 (1)在U3内有增强子和启动子； (2)U3和U5两端分别有病毒整合序列(IS) ； (3)在R内还有poly(A)加尾信号。

逆转录病毒前病毒的结构特点 （3）病毒有三个结构基因 (1)gag基因，编码核心蛋白及属特异性抗原； (2)pol基因，编码逆转录酶； (3)env基因，编码病毒外壳或包膜糖蛋白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。（4）5ˊ端LTR下游有一段病毒包装所必需的包装信号序列（ψ）及剪接供体位点(SD)和剪接受体位点(SA)。

逆转录病毒前病毒的结构特点 （5）含有负链DNA转录的引物结合位点(PBS)和正链DNA转录的引物结合位点(PPT)。

构成逆转录病毒介导的基因转移系统——逆转录病毒载体由两部分组成：构成逆转录病毒介导的基因转移系统——逆转录病毒载体由两部分组成： (1)保留病毒颗粒的包装信号而缺失病毒蛋白基因

(2) 辅助细胞株(如PA317)：它由缺陷型逆转录病毒感染构建而成

Retroviral packaging system

逆转录病毒载体 重组逆转录病毒 (核酸部分只能是逆转录病毒载体) LTR φ 目的基因标记基因 LTR 1 3 4 2 5 辅病毒 LTR gag pol env LTR LTR 目的基因标记基因 LTR Gag蛋白 PoL蛋白 Env蛋白包装细胞系靶细胞假病毒颗粒的产生并感染靶细胞

逆转录病毒载体的特点 ①逆转录病毒包膜上由env编码的糖蛋白，能够被许多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别，从而使逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。 ②逆转录病毒结构基因gag、env和pol的缺失不影响其他部分的活性。 ③前病毒可以高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因在靶细胞中的永久表达。 ④包装好的假病毒颗粒（携带目的基因的重组逆转录病毒载体）以芽生的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中，易于分离制备。

逆转录病毒载体的主要缺点 随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危险；逆转录病毒载体的容量较小，只能容纳7 kb以下的外源基因。

（2）腺病毒(adenovirus，AV)载体 腺病毒是一种大分子(36 kb)双链无包膜DNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，但目前尚未发现与肿瘤发生有关联。宿主细胞范围广，可感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。

腺病毒的优点 1.基因导入效率高，对人类安全； 2.宿主范围广； 3.基因转导与细胞分裂无关； 4.重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注； 5.腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb外源基因；

腺病毒载体缺点 1.不能整合到靶细胞的基因组DNA中。分裂增殖快的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的机会增多，表达时间相对较短。 2.宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。 3.有两个环节可能产生复制型腺病毒。 (1)腺病毒产生过程中与293辅助细胞内E1区序列发生同源重组； (2)腺病毒载体与被治疗的患者体内已感染的野生型腺病毒，甚至乳头瘤病毒、巨细胞病毒发生重组。 4.靶向性差。

AAV Virus Particles （3）腺病毒相关病毒载体腺病毒相关病毒(adenovirus associated virus，AAV)是一类单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组DNA小于5 kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。AAV不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。

Structure of AAV Virus Genomic DNA REP:病毒复制基因, CAP:编码衣壳蛋白的基因

AAV的特点 ● 以潜伏感染为主； ● 病毒基因组与细胞共存； ● 只要宿主细胞正常，AAV基因表达就处于抑制而维持潜伏状态； ● 若细胞受刺激，表达应激基因，AAV基因表达从而使AAV病毒复制； ● 产生子代病毒并释放，又感染新的细胞，建立新的潜伏状态。

AAV载体是目前正在研究的一类新型安全载体，它对人类无致病性。 AAV可以高效定点整合至人19号染色体的特定区域19q13.4中，并能较稳定地存在。这种靶向定点整合可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因可以持续稳定表达，并可受到周围基因的调控，兼具逆转录病毒载体和腺病毒载体两者的优点。

AAV载体的缺陷：

2.非病毒载体介导的基因转移系统 （1）脂质体介导的基因转移技术脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。基本原理:利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。

脂质体介导的基因转移示意图

脂质体介导法缺点： 脂质体介导进入靶细胞内，易被单核-吞噬细胞系统选择性吞噬、降解。

（2）受体介导转移技术 将DNA与细胞或组织亲和性的配体偶联，可使DNA具有靶向性。这种偶联通常通过多聚阳离子（如多聚赖氨酸）来实现。多聚阳离子与配体共价连接后，又通过电荷相互作用与带负电荷的DNA结合，将DNA包围，只留下配体暴露于表面。这样形成的复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮，从而将外源DNA导入靶细胞。缺点：受体介导的DNA通常进入细胞溶酶体内被降解。

受体介导转移技术示意图

（3）基因直接注射技术 不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露基因DNA注入动物肌肉或某些器官组织内。动物实验表明：接受注射外源DNA的小鼠能够按其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。 1.将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加30%～40%； 2.将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素； 3.肌内注射凝血因子Ⅸ基因，可产生血友病所需的凝血因子等等。

第九章 基因治疗