Biotecnologie ed Evoluzione della Terapia Medica dei Tumori Solidi

1. Dr. Francesco Graziano Medical Oncology Hospital of Pesaro Biotecnologie ed Evoluzione della Terapia Medica dei Tumori Solidi European Commette for Genetic Cancer Research

2. Terapia dei tumori Stadio I-II Stadio III Stadio IV chirurgia chemioterapia della malattia metastatica chemioterapia primaria radioterapia chirurgia guarigione chirurgia prolungamento della sopravvivenza palliazione guarigione prolungamento della sopravvivenza

3. Riduzione della massa tumorale Obiettivi della chemioterapia antitumorale negli stadi avanzati (stadio IV) Aumento della sopravvivenza Beneficio sui sintomi

4. Sviluppo storico della chemioterapia antineoplastica 1945 Mecloretamina 1950 Metotrexato 6-Mercaptopurina Busulfan 1955 Clorambucil Ciclofosfamide 1960 Vinblastina, vincristina Fluorouracile, actinomicina D Melfalan 1965 • Prima chemioterapia adiuvante • con actinomicina D nel tumore • di Wilms Procarbazina, 6-tioguanina Citosina arabinoside Adriamicina 1970 Bleomicina, dacarbazina da G. Bonadonna, 1999 (modificata)

5. Sviluppo storico della chemioterapia antineoplastica (II) 1975 • CMF adiuvante nel ca. mammario • Terapia adiuvante nell’osteosarcoma • Trapianto di midollo osseo • PVB nei tumori del testicolo CCNU, BCNU, cisplatino 1980 • Inizio chemioterapia primaria in • vari tumori solidi resecabili Etoposide, mitoxantrone 1985 • Trapianto autologo con GM-CSF • Espansione chemioterapia primaria Carboplatino Ifofosfamide + MESNA 1990 Paclitaxel, docetaxel Topotecan, irinotecan Gemcitabina Oxaliplatino • Terapia antiemetica 1995 Target therapy 2000 da G. Bonadonna, 1999 (modificata)

6. Sintesi pirimidinica Sintesi purinica • ACIDO FOSFONACETIL-L-ASPARTICO • Inibisce la biosintesi purinica • PENTOSTATINA • Inibisce l’adenosina deaminasi • IDROXIUREA • Inibisce la ribonucleotide reduttasi • 6-MERCAPTOPURINA • 6-TIOGUANINA • Inibisce la biosintesi • dell’anello purinico • Inibiscono le intercorversioni • nucleotidiche ribonucleotidi • 5-FLUOROURACILE • Inibisce la sintesi dell’acido timidilico • CITARABINA • FLUDARABINA • 2-CLORODEOXIADENINOSINA • Inibiscono la sintesi del DNA • AGENTI ALCHILANTI • MITOMICINA C • CISPLATINO • PROCARBAZINA • DACARBAZINA • Formano addotti con il DNA desossiribonucleotidi • METOTREXATO • Inibisce la riduzione • dell’acido diidrofolico • Blocca la sintesi purinica • e dell’acido timidilico DNA • BLEOMICINA • ETOPOSIDE • TENIPOSIDE • Danneggiano il DNA e • ne impediscono il riparo RNA (transfer, messaggero, ribosomiale) • L-ASPARAGINASI • Deamina l’asparagina • Inibisce la sintesi proteica • PACLITAXEL • ALCALOIDI DELLA VINCA • COLCHICINA • Inibiscono le funzioni dei • microtubuli • DACTINOMICINA • DAUNORUBICINA • DOXORUBICINA • MITOXANTRONE • Si intercalano nel DNA • Inibiscono la sintesi dell’RNA proteine enzimi (ecc.) microtubuli

7. Farmaci NON target! MIDOLLO OSSEO EMATOPOIETICO • Leucopenia, immunodepressione, • Piastrinopenia • Anemia MUCOSA GASTRO-INTESTINALE • Stomatite • Enterite arigenerativa • Colite mucosa-membranosa • Diarrea CUTE ED ANNESSI CUTANEI • Alopecia GONADI • Amenorrea, azoospermia Tossicità arigenerativa dei chemioterapici antitumorali

8. Changing of the Guard A Paradigm Shift in the Treatment of Cancer • Conventional cytotoxic drugs interact with DNA to prevent cell replication but are not specific to cancer cells • We are moving to targeted therapies which specifically target cancer cells

10. Target therapy: • Identificazione del bersaglio • Sopravvivenza e crescita delle cellula tumorale dipendono dal bersaglio

11. …. la comparsa degli “inib” e degli “umab” ...

12. Targeted Therapies • Monoclonal antibodies: proteine che si legano a recettore o altra molecola di segnale extracellulare • Tyrosine Kinase Inhibitors: molecola che lega e inibisce attività enzimatiche intracellulari • Gli “umab • Gli “inib”

13. umab umab I I I I I I Dalla biologia alla biotecnologia ai nuovi farmaci Second messanger ……….inib Transcription Translation Proteolysis From JB Gibbs, 2000, modified

14. Lo sviluppo degli “umab” e degli “inib” segue quello dei chemioterapici antitumorali Acquisizione Screening Produzione e Formulazione Studi clinici di fase I Studi clinici di fase II Studi clinici di fase III Pratica medica

15. Valutazione farmacologico-clinica dei chemioterapici antitumorali (I)

16. Valutazione farmacologico-clinica dei chemioterapici antitumorali (II)

17. Drug Development Timeline 2-4 yrs 3-6 yrs

18. Farmaci a Berasglio Molecolare

20. Carcinoma Renale Here Lies Interferon Killed by Sunitinib & Sorafenib

21. Located in the short arm of chromosome 3 Tumor suppressor function Found in up to 80% of sporadic (non-hereditary) renal cell cancers The Von-Hippel Lindau Gene

22. At birth First Hit Sporadic Renal Cell Cancer: VHL Two-Hit Hypothesis Second Hit: Cancer

23. VHL (+/-) Inactivation of VHL: An Early Step in Kidney Carcinogenesis Loss of remaining VHL allele Mutation/s at non-VHL loci VHL (-/-): Cysts VHL (-/-): Tumor

24. Elongin B/C Cul2 Rbx1 X X pVHL-E pVHL-A HIF HIF HIF HIF HIF HIF Consequences of VHL Gene Mutation Ubiquitin Ligase Complex Disrupted HIF Accumulation VEGF, PDGF Glut-1, Erythropoietin TGF-, CXCR4 Autocrine Growth Metastasis Angiogenesis Increased Metabolism

25. Sunitinib VEGF PDGF VEGFR PDGFR Pericyte/Fibroblast/ Vascular Smooth Muscle ↑ VEGF ↑ PDGF Vascular Endothelial Cell Sunitinib Vascular permeability Cell survival, proliferation, migration Vascular formation, maturation Inhibition of RCC pathogenesis and progression

26. pVHL HIF VEGF PDGF TGFa KDR PDGFR EGFR Horizontal “Targeted” Strategy

27. 1.00 Median PFS** Sorafenib = 24 weeks Placebo = 12 weeks Hazard ratio = 0.44 p-value <0.000001 0.75 Proportion of patients progression free 0.50 0.25 Sorafenib Placebo Censored observation 0 0 6 18 24 36 48 54 60 66 12 Time from randomization (weeks) TARGETsSingle, Planned Progression-Free Survival* Analysis *Independently assessed **PFS analysis performed March, 2005 (data cut-off Jan 28, 2005) Escudier B et al. Oral presentation, ASCO, 2005

28. EGFR TK Epidermal Growth Factor Receptor Extracellular Domain Transmembrane Domain Intracellular Domain

29. Human Epidermal Growth Factor Receptor Family TK TK TK No specific ligands - often acts as dimer partner NRG2 NRG3 Heregulins β-cellulin EGF, TGFa ,b Cellulin Amphiregulin, HB-EGF Heregulins erbB1HER1 EGFR erbB2 HER2 neu erbB3 HER3 erbB4 HER4

30. Epidermal Growth Factor Receptor Normal Cell Cancer Cell

31. EGFR expression in solid tumors Colorectal EGFR is expressed in a variety of solid tumors Lung (NSCLC) Head & Neck(SCC)

32. P P P P P P Structure of the EGF receptor and its mechanism of activation EGFR HER2 HER3 HER4 Ligand (e.g. EGF, TGF) 1. receptor dimerization Extracellular domain Cell membrane Tyrosine kinase domain 2. tyrosine kinase domain activation ATP ATP • transphosphorylation C-terminus domain Cytoplasmatic region • phosphorylation of • substrate tyrosines P P Inactive monomers • signal transduction From E. Raymond et al., 2000 (modified)

33. EGFR: FUNZIONE FISIOLGICA Una delle principali vie molecolari attivate dall’EGFR è quella di ras. Ras viene reclutata attraverso il legame con la molecola SOS.

34. EGFR: FUNZIONE FISIOLGICA A sua volta, ras determina l’attivazione della serina/treonina chinasi raf, delle MAPKK 1 e 2 e delle MAPK ERK 1 e 2.

35. EGFR: FUNZIONE FISIOLGICA Il risultato dell’attivazione di questa via molecolare è l’espressione di varie proteine nucleari, inclusa la ciclina D1 (necessaria per il passaggio G1-S nel ciclo cellulare).

36. EGFR: FUNZIONE FISIOLGICA Un altro target di EGFR è il PI3K

37. EGFR: FUNZIONE FISIOLGICA Il reclutamento di PI3K porta all’attivazione di Akt, una serina/treonina kinasi con forte attività antiapoptotica. N.B. la via di segnale di Akt svolge un ruolo nel determinare la chemioresistenza/ sensibilità della cellula neoplastica.

38. Targeting Cellular Signal Pathways umab inib Y EGFR Ras P P Raf MEKK PI3K Rho-B ERK sek Akt MAP kinase intermediates jnk/sapk C-myc C-jun Apoptosis N U C L E U S Ki-67

39. Anti-EGFR • Cetuximab • Panitumumab Anti EGFR antibody Mouse Chimeric Humanized Fully Human 34% Mouse 10% Mouse 100% Human 100% Mouse cetuximab matuzumab panitumumab

40. Colorectal cancer: cetuximab BOND Trial • Cunningham et al. ASCO 2003 • Randomized trial in 329/577 pts screened for EGFR+ tumors refractory to 5-FU/CPT-11 R CPT-11+cetuximab cetuximab

41. Mono Combo N 111 218 No. events 92 152 Median 1.5 4.1 HR (95% CI): 0.54 (0.42; 0.71) log rank p-value < 0.0001 Cetuximab vs. CPT-11+Cetuximab in CPT-11 refractory CRC Patients surviving (%) Patients free of progression (%) Mono Combo N 111 218 No. events 75 140 Median 6.9 8.6 HR (95% CI): 0.91 (0.68; 1.21) log rank p-value = 0.48

42. KRAS Mutations As an Independent Prognostic Factor in Patients With Advanced Colorectal Cancer Treated With Cetuximab Monoclonal antibodies R K K-ras mutato è sfavorevole

43. Strategie anti-EGFR TK TK PTEN Anticorpi monoclonali Piccole molecole anti-TK PI3-K GRB2 pY pY SOS pY RAS RAF STAT3 AKT MEK Gene transcription MAPK G1 M S Survival(anti-apoptosis) Proliferation/maturation G2 Chemotherapy /radiotherapyresistance Metastasis Angiogenesis

44. Gefitinib (piccola molecola anti-EGFR TK) Farmaco studiato nei carcinomi polmonari non a piccole cellule (esprimono EGFR) Small molecule TKIs R K

45. Differenze di risposta al gefitinib 1Fukuoka et al., JCO 2003; 2Kris et al., JAMA 2003; 3Miller et al., JCO 2004

46. Overexpression + mutation Normal Cell Cancer Cell

47. MUTAZIONI DI EGFR • l’effetto delle mutazioni di EGFR sulla funzione della proteina è ancora oggetto di ricerca; • le cellule che presentano forme mutanti di EGFR, vanno incontro a massiva apoptosi sotto l’azione di farmaci inibitori della via di segnale Akt e STAT-mediata.

48. 85% circa di queste mutazioni MUTAZIONI DI EGFR delezioni multinucleotidiche “in-frame” (ESONE 19) mutazioni puntiformi (ESONE 21)

49. MUTAZIONI DI EGFR • > frequenza nel sesso femminile; • > frequenza nelle popolazioni dell’est asiatico; • > frequenza nei non fumatori; • > frequenza nel tipo istologico adenocarcinoma.

50. Carcinoma del polmone (NSCLC) Carcinoma del colon 2 classi differenti di molecole anti-EGFR Small molecule TKIs Monoclonal antibodies R R K K EGFR mutato è favorevole K-ras mutato è sfavorevole