PCR / RT – PCR / QRT-PCR

1. PCR / RT – PCR / QRT-PCR

2. PCR • Polymerase chain reaction (PCR) este o tehnica de biologie moleculara care presupune amplificarea exponentiala a unei mici cantitati de ADN. • PCR a fost inventat de Kary Mulis si impreuna cu Michael Smith a obtinut premiul Nobel in 1993. • “Incepand cu o singura molecula de material genetic, PCR poate genera intr-o singura dupa amiaza 100 bilioane molecule similare. Reactia este usor de excutat: necesita doar un tub, cativa reactanti si o sursa de caldura” ( K. Mullis in Scientific American).

3. http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html

5. Revers transcriere PCR • Presupune amplificarea unei molecule de ARN; • ARN este trascris intr-o molecula de ADNc apoi in ADN dublu catenar; • Urmeaza procedeul de PCR clasic, care poate fi realizat intr-o etapa sau 2.

6. RT – PCR www.scielo.br/scielo.php?pid=S1678-7757200400...

7. RT - PCR http://www.bio.davidson.edu/Courses/immunology/Flash/RT_PCR.html

8. QRT - PCR • Real Time PCR cantitativ – tehnica utilizata pentru a cuantifica si in acelasi timp pentru a amplifica o secventa specifica dintr-o molecula de ADN. • AND-ul este cuantificat dupa fiecare fiecare ciclu de amplificare; acesta este aspectul “real time”. • Pentru cuantificare se folosesc: • coloranti fluorescenti care se intercaleaza in ADN-ul dublu catenar • nucleotide ADN modificate care emit fluorescenta atunci cand sunt hibridizate de un ADN complementar • QRT – PCR poate fi folosit si pentru cuantificarea ARN http://en.wikipedia.org/wiki/Real-time_polymerase_chain_reaction

9. Aplicatii ale QRT – PCR: • Monitorizarea incarcaturii virale • Quantificarea expresiei genice • Discriminarea alelica • Testarea GMO – organisme modificate genetic.

10. QRT-PCR • Cantitatea produsului de amplificat este direct proportionala cu intensitatea fluorescentei; • Semnalul fluorescent ajuta la calcularea cantitatii initiale de proba si poate fi masurat: • la sfarsitul reactiei (end point) • in timpul amplificarii (Real Time QPCR)

11. Real Time QPCR • Masoara fluorescenta dupa fiecare ciclu, in timpul procesului de amplificare; • Permite cuantificarea cantitatii initiale de proba in timpul amplificarii exponentiale, inainte de terminarea reactivilor, acumularea inhibitorilor sau inctivarea polimerazei;

12. Real Time QPCR: principiu • O molecula fluorescenta monitorizeaza progresul reactiei de amplificare; • Intensitatea fluorescentei creste direct proportional cu multiplicarea ampliconului, dupa fiecare ciclu; • “Ct” (ciclu prag)= primul ciclu la care sistemul optic poate detecta fluorescenta, ca urmare a amplificarii ampliconului. • Cu cat este mai mare cantitatea de ADN initial in proba, cu atat Ct va fi mai mic. • Daca se foloseste curba standard, softul va compara Ct standardelor cu Ct al probelor, si va determina concentratia de ADN initiala a fiecarei probe.

13. Instrumentele Stratagene – QPCR

14. Caracteristicile Mx3005P • 96 godeuri • Sistem optic de scanare • Sistem termic Pelter (uniformitate 0.25° C) • Rata de amplificare a temperaturii:2.5°C / sec • Sistem software pentru setarea placii, profilul termic, analiza finala.

15. Emission filter wheel Hot top Excitation filter wheel Thermal system Tungsten/Halogen Lamp Fiber optic cable and scanning arm Sistemul optic al Mx3005P

17. Asynchronous (scanning) Constant intensity(No positional effects) Simultaneous (CCD) Intensity depends on well position Lamp Higher intensity lower intensity Scanare versus iluminare si scanare simultana 3.5 s scanning time per dye

18. Detectarea fluorescentei

19. Organizare softului

20. Plate Setup SYBR Green 2-Fold Example.mxp

21. Thermal Profile Setup SYBR Green 2-Fold Example.mxp

22. Raw Data Plots SYBR Green 2-Fold Example.mxp

23. Consolidated Report SYBR Green 2-Fold Example.mxp

24. Real Time PCR

26. PCR / fluorescenta

29. Chimia QRT - PCR • SYBR Green • TaqMan • Molecular Beacons • Sorpions TM

30. Avantaje: Usor de folosit Ieftin Indicat pentru screning Dezavantaje: Detecteaza orice ADN dublu din reactie SYBR Green

31. Selectia primerilor • Obtinerea aceleiasi Tm pentru toti primerii: ideal - 60° C • 40 – 60% continut GC pentru a preveni autohibridizarea • Utilizarea aceluiasi soft

32. Avantaje: Secvente specifice Ofera posibilitatea de multiplexing (cuantificare comparativa) Dezavantaje: Greau de optimizat; Scump. Probe Taq Man

33. Probele lineare Taq man • Tm al probelor trebuie as fie cu 5 – 10 °C mai mari decat a primerilor • Molecule reporter si quencher compatibile.

34. Schitarea experimentului QRT - PCR • Optimizarea initiala trebuie sa identifice controale si standarde pe care sa se bazeze experimentele ulterioare

35. Strategia generala de optimizare a unui nou experiment QRT - PCR • Utilizarea SYBR Green • Proiectarea ampliconilor in vederea utilizarii ulterioare a multiplexului.

39. Martori pozitivi: Probe care contin gena de interes si care va fi detectata (similar cu probele de investigat) Martori negativi: No template control (NTC) – lipsa ADN-ului in reactie No reverse transcription Control (NoRT) No amplification control (NAC) – lipsa polimerazei Martori utilizati

42. Concluzii • Inainte de a analiza rezultatele, este important sa se verifice calitatea martorilor. • Ideal, nici un martor negativ nu trebuie sa depaseasca pragul de fluorescenta stabilit (contaminarea primerilor). • Daca martorii pozitivi nu arata amplificarea, se va pune in discutie daca probele negativate nu sunt de fapt rezultatul unei erori a reactiei PCR (prezenta inhibitorilor de PCR).

43. O primavara frumoasa!