บทปฏิบัติการที่ 2 การตรวจสอบจุลินทรีย์ในน้ำนม (Determination of Microorganism in Milk )

1. บทปฏิบัติการที่ 2 • การตรวจสอบจุลินทรีย์ในน้ำนม • (Determination of Microorganism in Milk ) • การตรวจสอบจุลินทรีย์โดยอ้อม • 2.1 เมทธิลีนบลูรีดักชั่นเทสต์ • 2.2 การตรวจสอบรีซาซูริน • การตรวจสอบจุลินทรีย์โดยตรง • 2.3 การนับจุลินทรีย์โดยกล้องจุลทรรศน์ • 2.4 การนับจุลินทรีย์บนจานเลี้ยงเชื้อ • 2.5 การตรวจแบคทีเรียโคลิฟอร์ม • การตรวจสอบแบคทีเรียอื่นๆ • 2.6 การตรวจหาแบคทีเรียโรคเต้านมอักเสบ • 2.7 การทดสอบยาปฏิชีวนะในน้ำนมด้วยโยเกิต

2. บทปฏิบัติการ 2.1 การตรวจสอบโดยการเปลี่ยนสีของเมทธิลีน บลู (Methylene Blue Reduction Test, MBRT) หลักการ (Principles) - MBRT เป็นวิธีการทดสอบจุลินทรีย์โดยทางอ้อม หลักการ: Methylene Blue เมื่ออยู่ในสภาวะที่มี O2 จะมีสีน้ำเงิน จะเปลี่ยนเป็นสีขาวในสภาพที่มี CO2 -ชั่วโมงการเปลี่ยนของ MRBT จะสัมพันธ์ตรงข้ามกับจำนวนแบคทีเรีย ข้อจำกัดอยู่บ้างในการตรวจสอบดังนี้ -แบคทีเรียบางชนิด เช่น S. agalactiae B. Subtilis จะเปลี่ยนสีได้ช้า -Somatic cell และเม็ดโลหิตขาวจะฟอกสี Methylene Blue ได้เช่นกัน

3. วิธีการ (Method) 1. ไปเปทสารละลายของ MRBT1 ml. ลงในหลอดตรวจสอบ 2. ไปเปทน้ำนมตัวอย่าง 10 ml. ลงหลอดทดสอบดังกล่าวพร้อมทั้งปิดฝา นำเข้าไปแช่ในอ่างน้ำอุ่น( 37+5 C) ปิดฝาอ่างป้องกันแสง 3. จับเวลาสังเกตการเปลี่ยนแปลงสีของเมธิลีน บลู ทุกๆช่วงเวลา 1/2, 1, 2, 3...7, 8 ชม. อ่านผลโดยกลับหลอดไป-มา แล้วดูลักษณะสีที่ปรากฏเห็นในแต่ละชม. 4. ทำหลอดควบคุมโดยใช้น้ำนม แต่ไม่ใส่สารละลายสี

4. การวิเคราะห์ผล

5. บทปฏิบัติการที่ 2.2 การตรวจสอบรีซาซูรีน (Resazurin Reduction Test, RRT) หลักการ (Principles) - RRT คือปฎิกริยา oxidation-reduction ของสารเคมีที่มีความไวเปลี่ยนสี - ใช้หลักการคล้าย MRBT -การเปลี่ยนสีของตัวอย่างน้ำนม จะอ่านผลภายใน 1 ชั่วโมง ขั้นตอนปฏิกิริยา ขั้น 1 Resazurin ----------------> Resorufin (สีน้ำเงิน) ( สีชมพู ) ขั้น 2 Resorufin ----------------> Hydroresorufin (สีชมพู) (ไม่มีสี, ขาว)

6. วิธีการ (Method) 1. ไปเปท รีซาซูรีน 1 ml. ใช้ในหลอดตรวจสอบ 2. ไปเปทตัวอย่างนม 10 ml. ใส่ลงไปในหลอดดังกล่าว ปิดฝาและกลับ หลอดไปมา 2-3 ครั้ง และนำไปวางในอ่างน้ำที่ อุณหภูมิ ( 37+5 C) ปิดฝาอ่างน้ำให้มิดชิด 3. เมื่อครบเวลา 1 ชั่วโมง นำหลอดทดสอบมาเทียบสีกับจานสี lovibond comparation

7. การวิเคราะห์ผล

8. บทปฏิบัติการ 2.3 • การตรวจนับจุลินทรีย์โดยกล้องจุลทรรศน์ (Direct Microscopic Count, DMC) • หลักการ (Principles) • -เป็นวิธีตรวจนับแบคทีเรียในน้ำนมโดยตรงด้วยกล้องจุลทรรศน์ • ให้ผลรวดเร็วและสิ้นเปลืองน้อย • แต่ต้องอาศัยความชำนาญ • วิธีการ (Method) • การเตรียมแผ่นสไลด์ตัวอย่างนม • โดยทำเครื่องหมายรูปสี่เหลี่ยมพื้นที่ 1 ตร.ซม. • ไว้ที่ใต้แผ่นสไลด์ 1 cm2

9. การทำ smear • -อุ่นน้ำนม (37 C ) และ กวนให้เป็นเนื้อเดียวกัน • -ใช้ loop ที่ฆ่าเชื้อแล้ว แตะน้ำนมตัวอย่าง 1 loop • (0.01 ml. ) เกลี่ยลงบนพื้นที่สี่เหลี่ยมให้เต็มและเรียบ • -ปล่อยแผ่นสไลด์ให้แห้งบนถาดอุ่นสไลด์ • 3 การย้อมสี • -จุ่มแผ่นสไลด์ที่ทำ smear แล้ว ลงใน Xylene นาน 1-2 นาที เพื่อขจัดไขมัน • -ล้างสไลด์ด้วยน้ำเปล่า โดยเปิดน้ำก๊อกเบาๆ รินผ่านสักครู่ แล้วปล่อยให้แห้ง • - นำแผ่นสไลด์ที่แห้งแล้ว มาจุ่มแอลกอฮอล์ 95% นาน 1-2 นาที เพื่อ fix smear • แล้วตากให้แห้ง • -นำสไลด์มาย้อมด้วยสี Loeffler's methylene blue โดยหยดน้ำยาสี 1-2 หยด • ให้น้ำยาท่วมแผ่นสไลด์ ทิ้งไว้ 2 นาที ล้างสีออกด้วยน้ำเปล่าอีกครั้ง • -แล้วตากแห้ง ก่อนนำไปส่องในกล้องจุลทรรศน์ต่อไป

10. การใช้กล้องจุลทรรศน์ • -ปรับกล้องจุลทรรศน์ เริ่มจากกำลังขยายต่ำ 40 X • แล้วจึงปรับไปที่หัวoil • ข้อสังเกตในการตรวจ • - แบคทีเรียย้อมติดสีน้ำเงินเข้ม • - เม็ดเลือดขาวย้อมติดสีน้ำเงินเข้ม • - โซมาติกเซลล์ย้อมติดสีน้ำเงินเข้ม • - โปรตีนย้อมติดสีฟ้าเป็นพื้นหลัง • - ไขมันย้อมติดสีขาวหรือไม่ติดสี • - สิ่งสกปรก,ฝุ่นย้อมติดสีเป็นเม็ดดำหรือน้ำตาล

11. การคำนวณจำนวณแบคทีเรีย (Calculation) • จำนวนแบคทีเรียใน 1 ml. =ค่าเฉลี่ยจำนวนแบคทีเรียใน 1 field x conversion factor • ยกตัวอย่างการคำนวณหาแบคทีเรียในน้ำนม • กล้องจุลทรรศน์มีหัวoil เส้นผ่าศูนย์กลางเท่ากับ 0.21มิลลิเมตร • จำนวนโคโรนีที่นับได้ใน 30 flied คือ45 • จำนวนแบคทีเรียในน้ำนม? • 1. หาค่าเฉลี่ยจำนวนแบคทีเรียใน 1 field = 45 / 30 = 1.5 • 2. จำนวนแบคทีเรียในน้ำนม = 1.5 x 300,000 • = 450,000เซลล์ / ml.

12. บทปฏิบัติการ 2.4 การนับจุลินทรีย์บนจานเลี้ยงเชื้อ (Standard Plate Count, SPC) หลักการ (Principles) -วิธี Standard Plate Count นี้เป็นการเพาะเลี้ยงเชื้อในอาหารที่จุลินทรีย์ส่วนมากสามารถเจริญเติบโตได้ -หลังจากนั้นแล้วจึงนับจำนวนโคโลนี (colony) -ค่าที่ได้บ่งชี้ถึงความสะอาดของน้ำนมดิบ(ความสะอาดในการรีดนม และความสะอาดของอุปกรณ์ โรคเต้านมอักเสบ)

13. วิธีการ (Method) • การวางแผนการทำ Dilution • ในน้ำนมดิบจะมีจำนวนแบคทีเรียอยู่เป็นจำนวนมาก จึงต้องทำเจือจางก่อนเพาะเลี้ยง • ขั้นตอนการเตรียม dilution น้ำนมชนิดต่าง ๆ 1 ml. 1 ml. 1 ml. 1 ml. 9 ml. H2O 1:10 A 9 ml. H2O 1:100 B 9 ml. H2O 1:1000 C 9 ml. H2O 1:10,000 D Dilutionที่เหมาะสมควรมีจุลินทรีย์เกิดอยู่ในช่วง 30-300 โคโลนี

14. การเลือกใช้ dilutions กับน้ำนมชนิดต่าง ๆ

15. SPC กลุ่ม ............. Control วันที่ SPC กลุ่ม ............. ตัวอย่างน้ำนมดิบ Dilution 1: 10 วัน 4. การเพาะเชื้อ 4.1 นำจานที่จะใช้ มาเขียนชื่อตัวอย่างน้ำนม • การหยด Dilution • .-ใช้ ไปเปท ลนไฟ ก่อนดูดน้ำนมจาก dilution ต่างๆ ที่ทำไว้ • จำนวน 1 ml. ลงในจานเลี้ยงเชื้อ • 2. การเท Agar ( ตรวจอุณหภูมิagarต้องไม่ร้อนเกินไป • ใช้หลังมือแตะขวดพอทนได้) • - ใช้ไฟตะเกียงลนปากขวดagar ก่อนเปิดฝา • - และเท agar ประมาณ 15 ซีซี สู่จานเลี้ยง • วางจานบนโต๊ะใช้มือจับฝาจาน แกว่งตัวจาน • ในแนวราบบนโต๊ะให้ agar เข้ากันดี

16. 4.4 วางรอจน agar แข็งตัว นำเข้าอบที่อุณหภูมิ 32 C นาน 48 ชั่วโมง การวางจานนั้นต้องกลับคว่ำจานเลี้ยงเชื้อลง 4.6 เมื่อครบ 48 ชั่วโมง แล้วนำออกมานับจำนวนโคโลนีโดยใช้เครื่อง (colony counter) และรายงานผลในหน่วยของโคโลนีต่อml.ของน้ำนม ( colony/ml )

17. 5. การอ่านผล 5.1 เลือกนับจากจานที่มีจำนวนโคโลนี 30-300 โคโลนี หากทุกจานมีมากกว่า 300 โคโลนีให้ รายงานเป็น นับไม่ได้ จำนวนแบคทีเรียที่นับได้ในแต่ละจาน=จำนวนแบคทีเรียที่นับได้ / ค่า dilute ตัวอย่างเช่น นับจำนวนแบคทีเรียได้ 250 โคโลนีที่ dilution 1 x 10 - 3 (0.001) จะมีจำนวนแบคทีเรีย = 250 / 0.001 = 250,000 cfu/ml หรือ = 250 x 1,000 = 250,000 cfu/ml *cfu = colony forming unit

18. บทปฏิบัติการที่ 2.5 การตรวจสอบแบคทีเรียโคลิฟอร์ม -เป็นวิธีที่ใช้ตรวจสอบน้ำนมภายหลังจากที่ทำการฆ่าเชื้อแล้ว -ลุ่มโคลิฟอร์มได้แก่ Coliform bacteria จำพวก gram-negative เช่น Escherichia (E. Coli) กับ Enterobacter (หรือ Acrobacter) ความสำคัญของแบคทีเรียโคลิฟอร์ม 1. โคลิฟอร์มเป็นแบคทีเรียที่พบได้ทั่วไปในนมดิบ 2. โคลิฟอร์มไม่ทนในอุณหภูมิฆ่าเชื้อนมพาสเจอร์ไรส์ ดังนั้นการพบแบคทีเรียในน้ำนมที่พาสเจอร์ไรส์แล้ว แสดงว่ามีการปนเปื้อน

19. วิธีการ (Method) -อุ่น Agar ให้อยู่ในสภาพละลาย -เติมน้ำนม dilutionตัวอย่างละ 1 ml. ต่อ 1 จาน ( หากเป็นน้ำนมดิบให้ใช้ Dilution 1:10, 1:100 และน้ำนมพาสเจอร์ไรส์ใช้ 1:1, 1:10) -ให้เท วุ้นแดง( Violet red bile agar) ทับในแต่ละจาน จานละ 10 มล. หมุนจานให้ส่วนผสมเข้ากันและตั้งทิ้งไว้ให้วุ้นแข็ง -นำจานวุ้นที่แข็งตัว บ่มในตู้อุณหภูมิ 37 C นาน 24 ชม. -เมื่อครบเวลาให้นำจานออกมาตรวจนับ -ลักษณะโคโลนีจะเป็นสีแดงเข้มขึ้นอยู่ในเนื้อวุ้น -รายงานผลเป็น โคโลนีต่อมล. = จำนวนโคโลนี/จาน x อัตราเจือจาง

20. บทปฏิบัติการที่ 2.6 • การตรวจโรคเต้านมอักเสบโดยวิธี California Mastitis Test • -CMT เป็นวิธีที่ใช้การประมาณค่า somatic cell โดยอาศัยปฏิกิริยาของ Sodium hydroxide ซึ่งจะทำให้เซลล์แตกสลาย และ ทำให้โปรตีนของเม็ดโลหิตขาวเกิดการตกตะกอน • จับกันเป็นก้อนหนืด ปรากฎให้เห็นด้วยตาเปล่า • วิธีการ ( Method ) • 1. ใช้ไปเปทดูดน้ำนมใส่ในจานหลุมทั้ง 4 จาน ๆ ละ 2-5 ml. • 2. ไปเปท CMT ใส่จานทั้ง 4 จาน (น้ำยา CMT : น้ำนมตัวอย่าง = 1:1) • 3. แกว่งถาดจานหลุมวนเป็นวงกลมอย่างช้า ๆ ให้คะแนนและสังเกตการเกิดตะกอนจับเป็นก้อนทันทีภายใน10 วินาที

21. หมายเหตุ : ระวังการอ่านผลตรวจน้ำนมจากโคแรกคลอดและช่วงปลายการให้นม ซึ่งจะให้ผลบวก

22. บทปฏิบัติการที่ 2.7 การทดสอบยาปฏิชีวนะในน้ำนมด้วยโยเกิต -ปัญหาน้ำนมที่พบบ่อย คือการปลอมปนยาปฏิชีวนะ หรือสารป้องกันการเสียของน้ำนม วิธีตรวจอย่างง่ายคือการทำโยเกิตเทส( Yogurt test ) -โดยน้ำนมที่มีสารกันนมเสียเมื่อใส่จุลินทรีย์จากโยเกิต เพาะเลี้ยงแล้วจะพบว่าเชื้อตาย -ต่างกับน้ำนมที่ไม่มีสารป้องกันเสีย เชื้อจะเจริญได้ ทำให้น้ำนมเกิดตะกอน

23. การตรวจสอบยาปฏิชีวนะเบื้องต้นโดยวิธี PlainYoghurt วิธีการ 1.ใช้โยเกิตจืด 1 ถ้วย (150 กรัม) ผสมน้ำเย็น 150 มล. คนให้เข้ากัน 2.นำน้ำนมดิบ 10 มล. ต้มเดือด 10 นาที และปรับอุณหภูมิ 35-37 C 3.ใส่โยเกิตที่เตรียมไว้ 1 ซีซี. ลงในหลอดน้ำนม เขย่าให้เข้ากัน 4.บ่มในWater Bathอุณหภูมิ 48 C นาน 3 ชั่วโมง 5.ทำตัวอย่าง Bank และControl เพื่อเปรียบกับผลจากน้ำนมดิบ การอ่านผล -ถ้าตัวอย่างน้ำนมมีการจับตัวเป็นก้อน/หนืด อ่านผลเป็นลบ(-) คือไม่มีสารยับยั้งจุลินทรีย์ -ถ้าตัวอย่างน้ำนมยังเป็นน้ำนมปกติ ไม่หนืดให้อ่านผลเป็นบวก(+) คือ อาจมีสารยับยั้งการเจริญเติบโตจุลินทรีย์

24. การตรวจสอบยาปฏิชีวนะโดยวิธี Yoghurt with Bromocresol Purple -ใช้ โยเกิตรสจืดไม่ต้องเจือจาง -ใช้นม 2 ซีซี. ต้มในน้ำเดือด 10 นาที และปรับอุณหภูมิ 35-37 C -ผสมโยเกิต 0.1 ซีซี. ประมาณ 1 หยด + BCP 0.2 ซีซี.( 2 หยด) เขย่าให้เข้ากัน -บ่มใน Water Barth อุณหภูมิ 45 C นาน 3 ชั่วโมง การอ่านผล ตัวอย่างถ้ามีสีเหลือง = ผลลบ ตัวอย่างถ้ามีสีน้ำเงิน = ผลบวก