1 / 35

Peptydy

Aleksander Kołodziejczyk. Peptydy. Gdańsk 2011. Peptydy są to związki powstające w reakcji acylowania aminokwasów aminokwasami. Wiązanie peptydowe jest to wiązanie amidowe pomiędzy aminokwasami.

liora
Download Presentation

Peptydy

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Aleksander Kołodziejczyk Peptydy Gdańsk 2011

  2. Peptydy są to związki powstające w reakcji acylowania aminokwasówaminokwasami Wiązanie peptydowe jest to wiązanie amidowe pomiędzy aminokwasami

  3. W zależności od ułożenia grup funkcyjnych tworzących wiązanie peptydowe mogą być wiązania a-peptydowe i inne. Wiązania a-peptydowe powstają pomiędzy grupą a-karboksylową i a-aminową. Nomenklatura peptydów waliloalanylocysteinyloglicylo-g-glutamylo-Ne-lizyloseryloglicyna 1 2 3 4 5 6 7 8 Val-Ala-Cys-Gly-g-Glu-Ne-Lys-Ser-Gly N-terminalny C-terminalny VACG-g-E-e-KSG

  4. Val-Ala-Gly H-Val-Ala-Gly-OH cyklopeptydy cyklo(-Pro-Phe-Phe-Val-Pro-Pro-Ala-Phe-Pro-) Pro-Phe-Phe-Val-Pro-Pro-Ala-Phe-Pro

  5. Nagrody Nobla za osiągnięcia związane z peptydami 1902Emil Fischer badanie cukrów, synteza pierwszych peptydów 1923Frederick Banting odkrycie insuliny John Maclead 1952ArcherMartin opracowanie chromatografii peptydów, Richard Synge ustalenie budowy gramicydyny 1955Vincent du Vigneaud otrzymanie oksytocyny i wazopresyny, pierwszych biologicznie czynnych peptydów 1958Frederick Sanger ustalenie przestrzennej budowy insuliny Dorothy Hodgkin 1972Christian Anfinsen ustalenie budowy i wyjaśnienie działania Stanford Moorrybonuleazy, William Stein konstruktorzy analizatora aminokwasów 1977Roger Guillemin badanie hormonów mózgowych Andrew Schally Rosalyn Yalow 1980Walter Gibert badanie struktury białek i peptydów Frederick Sanger 1984Robert Merrifield synteza peptydów na fazie stałej

  6. Peptydy wytwarzane przemysłowo

  7. Chemiczna synteza peptydów

  8. Dobra osłona peptydowa powinna: być łatwa do wprowadzania; być trwała w takcie syntezy peptydu i jego oczyszczaniu; zapewniać dobrą rozpuszczalność chronionego AA; ułatwiać reakcję tworzenia wiązania peptydowego; utrudniać reakcje uboczne, w tym racemizację; zapewniać możliwość selektywnego lub/i równoczesnego usuwania wszystkich osłon; być łatwo usuwalna (w 100%). Syntetyczna rybonukleaza A, w której usunięto 83% osłon miała jedynie 70%aktywności biologicznejbiałkanatywnego.

  9. Osłony grupy aminowej Boc t-butyloksykarbonyl uretan – pochodna kwasu węglowego:

  10. Osłony grupy karboksylowej (głównie estry): Osłony grupy hydroksylowej: benzyl, t-butyl; acetyl (Ac-); trimetylosilyl – (CH3)3Si- Osłony grupy tiolowej: benzyl; acetamidometyl (AcNH-CH2-); t-butyl Osłony grupy imidazolowej: benzyl; t-butoksyl; formyl; benzyloksymetyl (Bom- – Bzl-O-CH2); - tosyl; Fmoc Osłony grupy guanidynowej: nitro (-NO2); tosyl, p-metoksybenzenosulfonyl (Mbs-); benzyloksykarbonyl

  11. METODY TWORZENIA WIĄZANIA PEPTYDOWEGO Metoda kardodiimidowa (DCC)

  12. Produkt uboczny N-acylomocznik

  13. Wydajność reakcji = wydajność Ac-Phe-Leu-OMe: 54% Stopień racemizacji E = 11% Reakcja z udziałem soli estru Metoda DCC z dodatkami obniżającymi racemizację

  14. Metoda mieszanych bezwodników mieszany bezwodnik chloromrówczan s-butylu Metoda aktywnych estrów Aktywne estry: p-nitrofenylowe; pentafluorofenylowe; -OBt; -ONSu Metoda EEDQ N-etoksykarbonylo-2-etoksy-1,2-dihydrochinolina

  15. Metoda BOP heksafluorofosforantris(dimetyloamino)-1-benzotriazyloksy- fosfoniowy tris(dimetylo)fosforotriamid jest kancerogenny. Niekancerogenne odczynniki kondensuące. tetrafluoroboran [2-(1-benzotriazolo)]- -1,1,3,3-tetrametylouroniowy heksafluorofosforan tris(pirolidyno)- -1-benzotriazoliloksyfosfoniowy heksafluorofosforan bromo- tris(pirolidyno)fosfoniowy

  16. Metoda azydkowa Metoda azydkowa ma obecnie jedynie historyczne znaczenie. Dawniej uważana za „bezracemizacyjną” była stosowana do łączenia fragmentów peptydów. Inne metody łączenia fragmentów dawały produkty mocno zracemizowane. W metodzie azydkowej stopień racemizacji osiąga wielkość kilku procent. Racemizacji ulega aminokwas acylujący Stopień racemizacji zależy zarówno od metody stosowanej do utworzenia wiązania peptydowego, jak i właściwości komponentu acylującego; istotną rolę pełni rodzaj osłony grupy aminowej. Osłony uretanowe (Z, Boc, Fmoc) są bezracemizacyjne, tzn. podczas reakcji tworzenia wiązania peptydowego ulegają racemizacji w stopniu poniżej 0,1%.

  17. Ac-Leu + Phe-OMe Z-Gly-Leu + Leu-OMe CHO-D-Leu + Leu-OMe CHO-Leu + Leu-OMe Ac-D-Leu + Phe-OMe Ac-D-Leu + Leu-OMe Z-Gly-D-Leu + Leu-OMe Ac-Leu + Leu-OMe Z-Leu + Leu-OMe Reakcja 35 40 4 E 5 13 <0,1 70 34 21 AA zawierające osłony acylowe (Ac, Bz, CHO, Pht), a także AA acylowane innym aminokwasem (peptydem) racemizują znacznie podczas acylowania (aktywacji). Stopień racemizacji zależy również od wzajemnej konfiguracji aminokwasów tworzących wiązanie peptydowe. Zależność stopnia racemizacji E od konfiguracji reagentów

  18. Stopień racemizacji jest zależny nie tylko od właściwości reagujących komponentów aminokwasowych i rodzaju aktywacji, ale również od warunków reakcji, czylirozpuszczalnika,temperatury i czasu reakcji. Synteza peptydów i białek w komórkach jest w 100% bezracemizacyjna.

  19. Synteza peptydów na fazie stałej Synteza w roztworze nazywana jest syntezą klasyczną. W 1963 r. B. Merrifield zaproponował nową metodę syntezypeptydów, została ona nazwana syntezą na fazie stałej, SPPS - solid phase peptide synthesis. Synteza na nośniku stałym - SPPS P = polistyren sieciowany diwinylobenzenem N = nośnik

  20. Polimer do SPPS stosowany jest zwykle w postaci kuleczek o średnicy ziarna 20-100mm Ziarna są porowate, zawierająwiele kanalików. W tych kanalikach rosną łańcuchy syntezowanych peptydów. W ziarnie o średnicy 50 mm zawierającym 0,3 mmola peptydu na 1 g żywicy znajduje się 1012 łańcuchów peptydowych. Syntezę peptydów sposobem SPPS prowadzi się obsadzając ziarna żywicy pierwszym aminokwasem zwykle w granicach 0,2-0,7 mmola/g żywicy. Kanaliki muszą mieć odpowiednią średnicę, żeby pomieścić łańcuchy rosnącego peptydu. Przed rozpoczęciem syntezy polimer jest traktowany rozpuszczalnikiem, w którym pęcznieje powiększając rozmiary porów. Żywica Merrifielda (kopolimer styreno-diwinylobenzenowy) pęcznieje pod wpływem dichlorometanu zwiększając dziewięcio-krotnie swoją objętość.

  21. Zwykle poszczególne operacje na żywicy przeprowadza się w różnych rozpuszczalnikach. Zmianę rozpuszczalnika należy przeprowadzać stopniowo. Synteza peptydu na fazie stałej to powtarzające się cyklicznie operacje jednostkowe.

  22. Operacje jednostkowe liczba czas [min] A. Przemywanie – przygotowanie do deprotekcji 1. EtOH/AcOH, 1:1 1 1 2. AcOH 3 1 B. Deprotekcja 3. Wytrząsanie z 1M HCl/AcOH 1 5 4. Wytrząsanie z 1M HCl/AcOH 1 15 A. Przemywanie – przygotowanie do neutralizacji 5. AcOH 3 1 6. AcOH/EtOH, 1:1 1 1 7. EtOH 3 1 8. EtOH/DCM, 1:1 1 1 9. DCM 3 1 D. Neutralizacja 10. NEt3/DCM 1 2 11. NEt3/DCM 1 5

  23. E. Przemywanie – przygotowanie do acylowania 12. DCM 1 1 F. Acylowanie (ang. coupling) 13. Boc-AA (3 eq), DCC. DCM 1 120 14. Przemywanie DCM 1 3 15. Boc-AA (3 eq), DCC. DCM 1 60 G. Przemywanie – przygotowanie do testu Kaisera 16. DCM 3 1 17. DCM/EtOH, 1:1 1 1 18. EtOH 3 1 H. Test Kaisera 19. Sprawdzenie stopnia acylowania 1 7 Procedura zależy od stosowanych osłon, odczynników sprzęgających, a także od właściwości fizykochemicznych stosowanego nośnika. Nośnik może przypominać peptyd, np. żywica poliamidowa Scheparda W syntezie peptydów na żywicy Scheparda stosuje się osłony Fmoc. Usuwa się je w środowisku zasadowym. Po zakończeniu syntezy peptyd zdejmuje się z nośnika.

  24. Początkowo największym problemem SPPS była niska czystość peptydu, spowodowana niższą niż 100% wydajnością poszczególnych etapów reakcji, nie tylko acylowania, ale i deprotekcji i neutralizacji. Wydajność poszczególnych etapów reakcji udało się zwiększyć prawie do 100% poprzez stosowanie nadmiaru reagentów, a w razie potrzeby powtarzania etapu. Nadmiar odczynników w metodzie SPPS nie stanowi problemu, ponieważ łatwo je usunąć poprzez odsączenie i przemycie żywicy. Zwykle cena syntezowanego peptydu jest tak wysoka, że koszty nadmiarowych odczynników nie są brane pod uwagę.

  25. Peptydy błędne + .....

  26. Skład produktu końcowego w syntezie peptydów metoda SPPS 122-peptydy 123-peptydy Udział frakcji po ostatnim etapie syntezy rybonukleazy (124-peptydu) 8-peptydy 9-peptyd 7-peptydy Frakcja 15 38 Średnia wydajność poszczególnych etapów syntezy [%] 43 85 26 21 14 1 92 0,3 8 22 36 4 10 96 33 1 1 11 99 90 98 99 99,5 99,9 124-peptyd 8 29 54 88 Udział frakcji po ostatnim etapie syntezy oksytocyny (9-peptydu)

  27. Syntezy enzymatyczne

  28. CT: a-chymotrypsyna t-PenOH: t-pentanol HO-PEG-OMe: monometylowy eter poli(glikolu etylenowego) CT-O-PEG-OMe: CT kowalencyjnie związana z HO-PEG-OMe

  29. Wybrane przykłady zastosowania CT-O-PEG-OMe do syntezy peptydów Boc-D-Phe-Tyr-Cam Z-Phe-OCH2CF3 Z-Phe-OCH2CF3 Boc-Tyr-Gly-Gly-Phe-NHCH3 Z-PheOEt Z-Phe-OCH2CF3 Składnik acylujący Z-PheOEt LeuNH2 LeuNH2 Leu-OMe acylowany LeuNH2 D-Leu-OMe LeuNH2 LeuNH2 96 36 48 36 96 Czas reakcji [h] 96 48 70 15 63 90 8 78 Wydajność peptydu 40 14 4 10 15 22 8 Stopieńhy- drolizy % 17

  30. SyntezaLH-RH hormonu uwalniającego hormon luteinizujący luteinizing hormon releasin hormon pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-GlyNH2 dekapeptyd pEHWSYGLRPGNH2 pEHWSY-OMe + GLRPGNH2 0,10M 0,12M LH-RH pEHWSYGLRPGNH2 95%

  31. T: trypsyna CT: chymotrypsyna P: papaina CPD-Y: karbopeptydaza Y CLP: klostrypaina PPSE: specyficzna endoproteaza postprolinowa

  32. Synteza aspartanu – słodkiego peptydu aspartan Polisynteza Ze względu na duże zapotrzebowanie na peptydy skonstruowano syntezatory peptydów umożliwiające równoczesną syntezę kilkudzie-sięciu, a nawet kilkuset różnych peptydów. Takie operacje prowadzi się np. na prętach pokrytych glikolem polietylenowym lub innym polimerem zdolnym do przyłączenia C-końcowego aminokwasu. Pręty osadzone są w gniazdach bloku, a każde gniazdo zaopatrzone jest w system doprowadzający roztwory odczynników. Wypróbowano też syntezę peptydów w pojemniczkach podobnych do woreczków z herbatą ekspresową; takie woreczki można było w zależności od potrzeb umieszczać w różnych reaktorach.

  33. Synteza kombinatoryczna – biblioteki peptydów Tym sposobem wyselekcjonowano heksapeptyd: Ac-RRWWCRNH2 o bardzo wysokiej aktywności przeciwbakteryjnej z pośród mieszaniny zawierającej

More Related