第七章 白细胞血型

1. 第七章 白细胞血型 【目的要求】 1.掌握 HLA的基因定位及HLA区的结构、HLA 遗传特征、HLA命名原则 2.熟悉 HLA的分型方法及判型、HLA抗原的结 构 3.了解 HLA抗原分子的组织分布特征

2. 第一节 概 述 MHC是表达于脊椎动物有核细胞表面的一类高度多态、紧密连锁的基因群，因其编码的蛋白质产物——主要组织相容性抗原在组织相容性的决定中起主要作用而得名。小鼠的MHC称为H-2系统，

3. 人的MHC称为人类白细胞抗原系统 (HLA系统),是人类基因组中最复杂、多态性最高的遗传体系。其主要功能为参与自我识别、调节免疫反应和对异体移植的排斥作用。

4. 定位于动物与人某对染色体的特定区域，呈高度多态性。MHC的编码产物即MHC分子或MHC抗原，其表达于不同细胞表面，主要功能是参与抗原递呈、制约细胞间相互识别及诱导免疫应答。定位于动物与人某对染色体的特定区域，呈高度多态性。MHC的编码产物即MHC分子或MHC抗原，其表达于不同细胞表面，主要功能是参与抗原递呈、制约细胞间相互识别及诱导免疫应答。 “组织相容性抗原”:诱发移植排斥反应的抗原被称为移植抗原或组织相容性抗原，其中可诱导迅速而强烈排斥反应者被称为主要组织相容性抗原。

5. HLA研究简史 1958年 Dausset发现HLA-A2抗原，标志着 HLA研究的开始 1962年 Van Rood发现了4a，4b双等位基因 开辟了白细胞分型的道路 1964年 召开第一届国际组织相容性研讨会 揭开了HLA研究国际大协作的序幕 1965年 确定了HLA是人类主要组织相容性 抗原 1974年 证实了HLA系统位于人类第6号染色 体上 1999年 人类基因组计划将HLA编码基因全 部解密

6. HLA系统的结构与组成 1999年10月，HLA的全基因组DNA序列被测定公布。 HLA系统位于人类第6染色体短臂（6p21.31），全长3600kb，包含128个功能基因和96个假基因，等位基因总数超过500多个。HLA复合体代表一组密切连锁的基因群,所有基因均为共显性。HLA复合体分为三个区域

7. 从着丝点一侧起依次为Ⅱ类基因、Ⅲ类基因和Ⅰ类基因区域所在

10. H LA系统的基因座位(1997) HLA I类区域 HLAⅡ类区域 HLAⅢ类区域 HLA-A HLA-DRA C2 HLA-B HLA-DRB1~ HLA-DRB9 Bf HLA-C HLA-DQA1~HLA-DRA2 C4A HLA-E HLA-DQB1~HLA-DQB3 C4B HLA-F HLA-DPA1~HLA-DPA2 TNF HLA-G HLA-DPB1~HLA-DPB2 LTA HLA-H HLA-TAP1~HLA-TAP2 LTB HLA-J HLA-DMB HLA-LMP2 HSP HLA-K HLA-DMA HLA-LMP7 HLA-L HLA-DOB HLA-DOA

11. HLA可分为三类： I 类： HLA-A、HLA-B、HLA-C经典基因 HLA-E、HLA-G、 HLA-F非经典基因 存在部位：I 类分子存在于几乎所有的有核细胞表面。 II 类： 基因包括3个亚区： HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP HLA-DOB HLA-DMA等基因 存在部位：II类分子主要存在于抗原呈递细胞如B细胞和巨噬细胞，树突状细胞和活化T细胞也表达II类分子。

12. III类 基因位于II类基因和I类基因之间， 主要是与补体有关的C4A、C4B、Bf、C2等基因以及21-羟化酶（CYP21）基因、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）基因、热休克蛋白（heat shock protein，HSP70）基因和转录物基因B144、BAT1-T9、G1、G4、G6、G7、G8等。

14. HLA-I类与Ⅱ类抗原结构及细胞分 布 （一） HLA-I抗原的结构 HLA-A、B、C抗原是由第6号染色体相应Ⅰ类基因编码的α链(44kD)与第15号染色体编码的β2微球蛋白(β2 microglobulin，β2m，12kD)非共价结合的糖蛋白。α链由胞外区、跨膜区和胞内区组成。胞外区可进一步分为α1、α2和α3 三个功能区。

15. 　跨膜区含疏水性氨基酸，排列成α螺旋，跨越脂质双分子层。胞内的氨基酸被磷酰化后有利于细胞外信息向胞内传递。β2m无同种特异性，与α3功能区连接，其功能为有助于Ⅰ类抗原的表达和稳定性

16. Ⅰ类抗原分子顶部α1和α2区组成的抗原肽结合区呈沟槽状结构，α1和α2区各含4股β片层和1个α螺旋，可容纳8～12个氨基酸残基组成的短肽。 沟槽内氨基酸变化大，是Ⅰ类抗原多态性的基础。α3与β2m具有Ig恒定区样结构。α3为T细胞CD8分子的识别部位。

18. (二)HLAⅡ类抗原的结构 HLA-DP、DQ、DR等Ⅱ类抗原是由Ⅱ类基因编码的α链(34kD)和β链(29kD)非共价连接的糖蛋白。α链和β链，均由胞外区、跨膜区和胞内区组成。胞外区各含两个功能区α1、α2和β１、β2 。

19. α1和β1区各自盘绕成一个α螺旋和β片层构成沟槽的一个侧壁和半个底面。沟槽与多肽结合的特点基本上与Ⅰ类抗原相似，但被结合的多肽一般来自外源性抗原经加工处理降解的产物。α2、β2区靠近细胞膜，具有Ig样结构α1和β1区各自盘绕成一个α螺旋和β片层构成沟槽的一个侧壁和半个底面。沟槽与多肽结合的特点基本上与Ⅰ类抗原相似，但被结合的多肽一般来自外源性抗原经加工处理降解的产物。α2、β2区靠近细胞膜，具有Ig样结构

23. （三） HLA -Ⅰ、 II类分子的分布 HLA -Ⅰ类分子主要分布于机体所有有核细胞表面（包括血小板和网织红细胞），以淋巴细胞表面Ⅰ类分子的密度最大，其次为肾、肝及心脏，密度最低的为肌肉和神经组织。 HLA -Ⅱ类分子仅表达于专职抗原递呈细胞（B细胞、巨噬细胞、树突状细胞、郎格汉斯细胞）以及活化的T细胞和胸腺上皮细胞等表面 。

24. 第二节 HLA命名 命名原则： 1.每一种因子前冠以HLA，后用英文大写字母表示基因座，如HLA-A，B 2.用阿拉伯数字代表特异性，如HLA-A1，HLA-B8 3.凡数字前加“W”符号的表示未确定的抗原，经WHO认可后即可取消“W”符号 4.HLA基因以4位数字表示，前2位数字表示最相近的特异性，后2位数字表示亚型特异性。如编码A1抗原的两个等位基因分别是A※0101与A※0102

25. 5. 第五位数字代表核苷酸的碱基取代，称为“沉默取代”，不影响其编码的氨基酸序列。 如A※31011与A※31012的DNA序列虽然不同，但A31抗原氨基酸序列不受影响 6. 第6、7位数字代表相应启动子序列的多态性 7. 数字末尾加N表示无效基因

26. 第三节:HLA遗传 一.HLA基因定位与基因结构 HLA结构十分复杂,其多样性由多基因性和多态性两方面构成. 多基因性指复合体由多个位置相邻的基因座位所组成,编码产物具有相同或相似的功能. 根据结构和功能,组成HLA的基因 传统分为三类: HLA-I 、II、Ⅲ类 新分类：经典的HLA I类和II类基因 免疫功能相关基因

27. 1．经典的HLA-Ⅰ类基因 包括HLA-B、-C、-A，它们具有多态性， 编码HLA-Ⅰ类分子，主要生物学功能是参与递呈内源性抗原 2. 经典的HLA-Ⅱ类基因 包括HLA-DP、-DQ和-DR，它们也具有高度多态性，编码HLA- Ⅱ类分子，主要生物学功能是递呈外源性抗原

28. HLA复合体Ⅰ类和Ⅱ类基因区内的基 因 名 称

29. 二.HLA遗传特征 (一)单倍型遗传 连锁在一条染色体上的HLA各位点的基因组合称为HLA单倍型(HLA haplotype)。 两个同源单倍型构成HLA的基因型(HLA genotype)。由于一条染色体上HLA各位点之间距离非常近，很少发生同源染色体间的交换。

30. 当亲代的遗传信息传给子代时，HLA单倍型作为一个单位遗传给下一代。因此，子女的HLA基因型中，一个单倍型与父亲相同，另一个与母亲相同。当亲代的遗传信息传给子代时，HLA单倍型作为一个单位遗传给下一代。因此，子女的HLA基因型中，一个单倍型与父亲相同，另一个与母亲相同。

31. 例如 父亲的HLA单倍型为a和b，母亲的是c和d，则其子女可出现ac、bc、ad和bd 4种单倍型组合。这样，亲代与子代间有一个单倍型是相同的。 同胞间，HLA单倍型完全相同的机率为25％，完全不相同的机率亦为25％，一个单倍型相同的机率为50％。

32. 　因此，从家庭内寻找器官移植的供者，其供、受者HLA抗原型别相同的机率比在无血缘关系的供、受者中高得多。

33. (二)共显性遗传 HLA复合体为共显性遗传，即每对等位基因都能编码抗原，共同表达于细胞膜上，而不形成ABO血型系统中的隐性基因及免疫球蛋白基因中的等位基因排斥现象，这就大大增加了HLA抗原系统的复杂性和多态性。

34. （三）HLA的多态性 多态性：指一个基因座位上存在多个等位基因。 对同一个体而言，染色体上任一基因座位只能有两个等位基因，分别来自父、母的同源染色体。 HLA的多态性是一个群体概念，指群体中不同个体在等位基因拥有状态上存在差别 。

35. HLA多态性的产生机制: 1．复等位基因 (multiple allele) 在群体中，位于同一基因座的不同基因系列即为复等位基因。 HLA复合体的多数基因座均有复等位基因。 2．共显性(co-dominant)表达 共显性即两条染色体同一基因座每一等位基因均为显性基因，均能编码特异性抗原。

36. HLA多态性的意义: 1．赋予种群适应多变的环境条件 2．实现对机体免疫应答的遗传控制 3．使HLA成为个体的终身遗传标志 4．增加了寻找合适同种器官移植供者的难 度

37. (四)连锁不平衡 单倍型基因非随机分布的现象称为连锁不平衡(linkage disequilibrium)。如某些基因(A1与B8)经常在一起出现，其单倍型频率比理论值高，而另一些基因又较少出现。连锁不平衡产生原因尚不清楚。有人认为，连锁不平衡与某些疾病的发生有关。

38. 第四节.HLA的交叉反应 交叉反应：HLA抗体不仅针对刺激其产生的抗 原，有时也针对相关的抗原，这种 现象称为交叉反应。 表 现：一种抗血清可以与多种抗原反应， 或一种特异性抗原可以与多种抗 体反应。

39. 原因： 1.HLA抗血清是多价抗血清，含有多种抗体 2.HLA由同一分子上一定数量高度相关的抗原因子组成，这些抗原因子具有不同的抗原性或免疫原性。 3.HLA的交叉反应可能是由复合抗原或复合抗体引起

40. 第五节 HLA分型 传统的血清学分型和细胞学分型技术主要侧重于HLA抗原特异性的分型，80年代建立的DNA分型技术则侧重于基因分析。

41. (一)血清学分型技术 1. HLAⅠ类抗原的检测 HLA-A、B、C抗原型别鉴定均使用补体依赖的细胞毒试验(complement dependent cytotoxicity，CDC)。

42. 基本原理： 　　标准分型血清中含有针对某种抗原特异性的细胞毒抗体，可与待测细胞表面相应HLA抗原结合,可以激活加入的补体，使细胞损伤或死亡。利用染料排斥试验判断受检细胞，受损或死亡细胞被染色为细胞毒阳性。细胞毒阳性细胞的HLA抗原型别与标准分型血清所针对的抗原相当。

43. 2. HLA-DQ、DR抗原的检测 该两抗原的检测方法同HLAⅠ类抗原，但所用的抗血清必须经过吸收(通常用多个个体的血小板来吸收)以除去其中的抗Ⅰ类抗原的抗体，待测细胞须用经过纯化的B细胞。

44. 标准分型血清多取自经产妇、计划免疫志愿者，或制备的HLA单克隆抗体。血清学分型是一项古老的技术，尽管近年来已建立许多新的技术，但它仍是目前HLA分型的基本方法。标准分型血清多取自经产妇、计划免疫志愿者，或制备的HLA单克隆抗体。血清学分型是一项古老的技术，尽管近年来已建立许多新的技术，但它仍是目前HLA分型的基本方法。

45. （二）细胞学分型技术 HLA-DP抗原特异性可应用纯合子分型细胞(homozygous typing cell，HTC)和预致敏淋巴细胞试验(primed lymphocyte test，PLT)检测。 两种方法的原理均是通过混合淋巴细胞培 养试验判断淋巴细胞在识别非己HLA抗原 后发生的增殖反应。由于分型细胞来源困 难以及实验方法繁琐，细胞学分型技术正 逐渐被淘汰。

46. (三)DNA分型技术 1. RFLP技术 即限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)分析技术，其基本原理是，个体间抗原特异性来自氨基酸顺序的差别，后者由编码基因的碱基顺序不同所决定。 此种碱基顺序的差别造成限制性内切酶识别位置及酶切位点数目的不同，从而产生数量和长度不一的DNA酶切片段。经电泳、转膜后，用标记的特异cDNA探针与之杂交，经放射自显影显示出不同长度的杂交条带。根据杂交条带的格局来判定HLA的型别

47. 将聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)与RFLP结合起来，可明显提高其灵敏度。由于本法仅能反映某限制性内切酶位点的改变，故有一定的局限性。

48. 94℃变性 50-65℃退火 XX℃延伸

49. 标准的PCR反应体系 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 　　　　 　 各10～100pmol 模板DNA 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L PCR的基本原理 • PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点

50. 1 2 3 高温变性 低温退火 适温延伸 94 温度 （℃） 72 55 22 1 2 3 4 5 时间（min） • PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点 PCR的基本原理 重复1~3步 25~30轮 DNA变性 形成2条单链 目的DNA片段 扩增100万倍以上 子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性 DNA双螺旋