1 / 35

Meditsiiniline Keemia Analüütiline keemia, Instrumentaalanalüüs

Meditsiiniline Keemia Analüütiline keemia, Instrumentaalanalüüs. Elektroforees ja massispektromeetria 8. Detsember 2008 Eva-Ingrid Rõõm. Elektroforees (EP). Forees tuleneb kreeka verbist phorēsis < phorein , mis tähendab (pidevalt, jätkuvalt) tassima, kandma.

lok
Download Presentation

Meditsiiniline Keemia Analüütiline keemia, Instrumentaalanalüüs

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. Meditsiiniline KeemiaAnalüütiline keemia, Instrumentaalanalüüs Elektroforees ja massispektromeetria 8. Detsember 2008 Eva-Ingrid Rõõm

  2. Elektroforees (EP) • Foreestuleneb kreeka verbist phorēsis < phorein, mis tähendab (pidevalt, jätkuvalt) tassima, kandma. • Seega elektroforees on lihtsustatult “elektri poolt kandmine”. • Elektroforees eraldab aineid nende liikumiskiiruse järgi elektriväljas. • Lahutatavad ained peavad esinema ioonidena. • Ioone liigutatakse vastavalt vastasmärgiliste laengute tõmbumise põhimõttele.

  3. Elektroforees (EP) • Iooni liikumiskiirus elektriväljas n: n= meE = meV/L me – elektroforeetiline liikuvus, ainele iseloomulik suurus, mille absoluutväärtus kasvab proportsionaalselt osakese summaarse laenguga z ja kahaneb proportsiaonaalselt osakesele keskkonna poolt avaladatava takistusega (tugevalt sõltuvuses osakese suurusest ja massist m). Summaarselt negatiivse laenguga ioonide korral on väärtus negatiivne. E – elektrivälja tugevus V - elektrivälja potentsiaal, elektroodide vaheline potentsiaal (V, voltides) L – elektroodide vaheline kaugus

  4. Elektroosmoos • Vedeliku liikumist elektriväljas nimetatakse elektroosmootseks voolamiseks. Liikumiskiirus: n= meoE meo – elektroosmootne liikuvus, sõltub selles sisalduvate ioonide suunatud liikumisest ühelt elektroodilt teiseni ja ka EP anuma kujust. Mõjutama hakkab EO tulemusi kapillaar-elektroforeesis. E – elektrivälja tugevus • Seega summaarne iooni liikumiskiirus elektriväljas ja LAHUSES: n= (meo + me)E • Negatiivselt laetud iooni korral onmenegatiivse väärtusega. • Seega võib iooni summaarne liikumine toimuda nii katoodi kui anoodi suunas.

  5. Elektroforeesi liigid • Elektroforees jaotatakse • Planaarseks elektroforeesiks (Slab electrophpresis, SEP) • Kapillaarelektroforeesiks (Capillary electrphoresis, CEP) • Planaarelektroforeesi läbiviimiseks kasutatakse peamiselt õhukesi geelikihte, kuid mõnikord ka paberit. • Kapillaarelektroforeesi korral kasutatakse ülipeeneid (läbimõõt mm-tes), vajaliku täidisega torusid, mida nimetatakse kapillaarideks.

  6. Planaarelektroforees • PE plaat võib olla asetatud nii püsti kui pikali • Plaadi vastasservad on ühendatud elektroodi-dega, mis tekitavad plaadis proovi lahuta-miseks vajaliku elektrivälja • Plaadi ühe elektroodi (harilikult katoodi) poolses otsas on proovi-lahuse jaoks süvikud • Peale proovi sisestamist lülitatakse sisse alalisvool ja proov lahutub vastavalt selle komponentide liikumiskiirusele • Peale proovi lahutamist saab proovi ilmutada tindiga või vaadata eeltöödeldud proovi UV-lambi abil • Harilikult võrreldakse proovi teadaolevate näidistega või uuritakse andmebaase • Proovi saab vajadusel välja lõigata ja edasi uurida/töödelda

  7. Kapillaarelektroforees Kapillaar aeg Detektor Proovilahus • Kapilaarkolonn on mõlemat otsa pidi puhveralhustes, mis sisaldavad ka elektroode • Ühest ostast sisestatakse proovilahus kas rõhu muutuse abil või elektivälja toimel • Proov lahutatakse kapillaris vastavalt komponentide liikumiskiirusele elektriväljas - + + Kõrgepinge allikas Kogumisanum puhverlahusega Lähteanum puhverlahusega • Kapillari väljundotsa lähedale on paigal-datud detektor, mis mõõdab kapillari läbivad ained • Tulemusena saadakse elektrofero-gramm, milles iga piigi pindala on võrdeline antud aine kogusega proovis

  8. Elektroforeesi meetodid • Erinevate lahutusmeetodite järgi jaotatakse elektroforees • Tsoonelektroforees (ZE) • Geelelektroforees (GE) • Isoelektriline fokusseerimine (IEP) • Isotahhoforees (ITP) • Kõiki meetodeid on võimalik kasutada nii SEP kui CEP korral.

  9. Tsoonelektroforees (ZE) Puhver B- A- C- Katood Anood - + • Antud meetodi korral on puhverlahuse koostis kogu lahutusalas ühesugune • Jaotumine toimub nii EP kui EO tulemusel • Meetod on eelkõige sobilik väiksemate ioonide lahutamiseks: atomaarsed ioonid (Cl-, Mg+), väiksemad anorgaanilised (NO3-, NH4+) ja orgaanilised (suhkrud, aminohapped) molekulaarioonid.

  10. Isotahhoforees (ITP) Kõrge liikuvusega puhver Madala liikuvusega puhver B- A- C- Katood Anood - + • Antud meetodis valitakse kaks erinevat puhver-lahust nii, et lähtepuhverlahuse ioonide liikuvus oleks väiksem kui lõpp-puhverlahuse ioonide liikuvus ning kõigi uuritavas aines sisalduvate ioonide liikuvuste väärtused on nende kahe vahel. • Rakendades elektrivälja hakkavad kõik ioonid liikuma vastavalt nende liikumiskiirusele (n= meoE). • Lahuses tekkiva potentsiaalivälja tõttu järjestuvad selles olevad ioonid vastavalt nende liikuvustele. • Peale järjestumist on kõigi ainete liikumiskiirus antud meedodi korral sama.

  11. Isoelektriline fokusseerimine (IEF) Pidev pH gradient Kõrge pH Madal pH B- A- C- Katood Anood OH- - H+ + • Antud meetodi korral koosneb lähtepuhverlahus lahustist ja erinevatest ainetest – amfolüütidest – millel on nii katioonsed kui anioonsed omadused. • Ka proovid on amfolüüdid, tavaliselt valgud või DNA, RNA • Elektrivälja mõjul tekib puhverlahusest erinevate pH väärtustega gradient • Proovi komponendid liiguvad sellise pH juurde, kus nende summarne ioonne laeng on neutraalne (oma pI ehk isoelektrilise punkti pH väärtuse juurde)

  12. Geelelektroforees (GE) • Antud meetodi korral on lahutuskeskkonnaks geel • Geeli poorse struktuuri moodustavad polümeersed ühendid (näiteks polüakrüülamiid või agaroos). • Poorimaatriksis olevas puhverlahuses toimub EF. • Antud meetodi korral on ainete lahutamise peamiseks mõjutajaks nende massi ja laengu suhe m/z, kuna peamine takistus liikumisel on poorimaatriks. • Kui ainele ja puhvrile lisatakse SDSi (naatrium-dodetsüülsulfaati) muudab see ainete laengu korreleeruvaks nende suurusega ja denatureerib uuritava aine. Tulemuseks on otseselt massist sõltuv ainete järjestumineelektroforeesi tulemu-sena. SDS PAGE on kõige laiemalt bioloogiliste proovide jaoks kasutatav EF meetod.

  13. GE ja IEF 1. IEF • Bioloogiliste proovide korral kasutataakse SDS PAGE tihti koos järgneva või eelenva IEFga (mis on samuti geelis läbi viidud). • Esimese mõõtmise tulemusel geelis tekkinud aineterida asetatakse teise geeliplaadi algusesse esialgse lahutusega ristiolevas suunas • Sellisel juhul saadakse lahutus nii ainete massi kui pI järgi. 2. GE pI M

  14. Detektorid • Planaarse elektroforeesi korral tavaliselt proov ilmutatakse erinevate tintidega või markeeritakse (eelenevalt) fluorestseeruvate markeritega UV-lambi all vaatamiseks • Teiste võimalustena on kasutusel • Spektroskoopilised meetodid • Massispektromeetria • Elektrokeemilised meetodid • Radiomeetria • Määramispiirid on väga madalad: määratav kogus on vahemikus 10-13...10-20 mooli.

  15. Kasutusvaldkonnad • Tänapäeval on elektroforees väga levinud just suuremate proovimolekulide analüüsimeetodina bioloogias, meditsiinis ja farmakoloogias. • Tüüpiline on valkude ja DNA ning RNA analüüs. • Eelkõige on kasutusel planaarne GE (eriti SDS PAGE) ja (geel)ITP kombineerituna erinevate eel- ja järeltöötlustega ning omavahel. • EP abil saab eristada ka näiteks omavahel ainult ühe aminohappe või nukleotiidi võrra erinevaid valke või polünukleotiide

  16. Massispektromeetria (MS) • Ainete määramine nende molekulidest tekitatud ioonide m/z väärtuste abil • m – iooni mass • z – iooni laeng • Spektromeetria on tulnud sõnadest specere (L) – vaatama, nägema ja metrum (L), metron (K) – mõõtma. Algselt mõeldi sp. all nähtava valguse spektri mõõtmist. Tänapäeval on spektromeetria mõiste laienenud kogu elektromagnetlainete skaala ulatusele ning hõlmab endas ka teisi skaalasid, nagu näiteks helilained ja massi-laengu suhed.

  17. Massispektromeetria lihtsustatud põhimõte • Analüüsimeetod, mille puhul: • Uuritavad molekulid (molekulmassiga M) aurustatakse • Need molekulid/aatomid ioniseeritakse • Tekivad ioonid M+, MH+ vms (molekulaarioonid) • Tekkinud ioonid on tihti kõrge energiaga ning fragmenteeruvad osaliselt, tekivad mitmesugused väiksema massiga ioonid (ja neutraalsed fragmendid) • Kõik ioonid suunatakse massianalüsaatorisse, mis registreerib nende masside ja laengute suhted m/z • Massispektromeeter registreerib ainult laetud osakesi.

  18. Massispektromeeter Proovisisestussüsteem • Massispektromeetria etapid: • Gaasifaasiliste ioonide genereerimine ja nende kiirendamine elektriväljas. • Ioonide eraldamine nende massi ja laengu suhte alusel elektri- ja/või magnetväljas. • Kindla massi ja laengu suhtega ioonide detekteerimine seadmega, mis on võimeline registreerima selleni jõudnud osakeste arvu. • Tulemus: massispekter. Ionisatsiooniallikas Ioonid Massianalüsaator(id) Ioonid Vaakum Detektor Massispekter

  19. Ioonide tekitamine • Gaasifaasist • EI (electron ionization) – levinuim gaasikromatograafi MS detektorite (GC-MS) korral. • CI (chemical ionization) • Vedelast faasist • ESI (electrospray ionization) – levinuim vedelikkromatograafi MS detektorite (LC-MS) korral. • APCI (atmospheric pressure chemical ionization) • Tahkest faasist • MALDI (matrix assisted laser desorption/ionization) – põhiliselt biokeemia rakendustes.

  20. Elektronionisatsioon • Kõige levinum ioonide tekitamise meetod on elektronionisatsioon (EI), mille puhul uuritavaid molekule pommitatakse elektronidega. • Elektronid “löövad molekulist välja” ühe elektroni ja seeläbi omandab molekul positiivse laengu. M + e– M•+ + 2e– • Tekkinud radikaaliooni nimetatakse molekulaariooniks. • Osakese liigse energia või ebapüsivuse tõttu võib see laguneda – fragmenteeruda: M•+  E+ + R• M•+  O•+ + N

  21. Pihustus-gaas N2 HPLC sisend Pihusti Pinge ~3500V + + Massi-spektro-meetrisse + + + + + + + + + + + + + kuum N2 Jäägid Elektropihustus-ionisatsioon (ESI) • Ioonid tekivad vahetult lahuses elektrivälja toimel ja “aurustuvad” sealt välja • Enamasti protoneerumine: M + H+ MH+ • Aurustumine tagatakse lahuse pihustamisega peeneteks tilkadeks • Ioonid juhitakse massi-spektromeetri sisendisse elektrivälja abil • ESI-MS on levinud detektor LC jaoks

  22. ESI Massispekter EI massispekter Molekulaarioon • Ionisatsioon on väga pehme – ei tekita fragmente. • Iseloomulik onlisandioonide ja mitmelaenguliste ioonide teke. • Ionisatsioon tekitab fragmente. • Iseloomulik on ühelaenguliste ioonide teke.

  23. MALDI • Matrix-assisted laser desorption/ionization. • Analüüsitav proov segatakse maatriksiga ja aurutataksekuivaks. • Kui sellisele proovile suunata laserkiir (Nd:YAG), siis maatriks aurustub koos analüüdiga. Tekivad analüüdi ioonid. • Maatriks peab neelama (elektromagnetkiirgust) kasutatava laseri sagedusel ja analüüt ei tohi sellel sagedusel kiirgust neelata. • Väga pehme – väga vähe fragmente. • Põhiliselt annab ühelaengulisi ioone.

  24. Molekul-mass 106 ESI 105 104 MALDI 103 EI 102 Polaarsus Apolaarne Keskm. polaarne Polaarne Iooniline EI, ESI ja MALDI

  25. Massianalüsaatorid • Kõik massianalüsaatorid lahutavad ioone kas elektrivälja ja/või magnetvälja mõjul muutes nende liikumise suunda (ja kiirust). • Ioone liigutatakse vastavalt • vastasmärgiliste laengute tõmbumise põhimõttele • liikuvale laetud osakesele mõjuva magnetvälja toimele • Mida väiksem on iooni mass, seda suurem on sama tugevusega välja mõju antud iooni kiirusele sama laengu korral. • Kindla elektri- ja/või magnetvälja tugevuse korral jõuavad detektorisse ainult kindla m/z-ga ioonid (v.a. TOF). • Kõik massianalüsaatorid töötavad sügava vaakumi tingimustes (10-6...-7 atm).

  26. Massianalüsaatorid • Magnetiline ja elektrostaatiline sektor • Enamasti mõlemad koos – topeltfokusseeriv MS • Klassikaline MS, põhimõtted küllalt lihtsad. • Kõrge lahutusvõimega. • Kvadrupool ja ioonlõks • Kasutatakse kromatograafias detektoritena. • Lennuaja (TOF) MS ja Orbitrap • Põhiliselt proteoomika rakendused. • Ioontsüklotronresonants-MS • Kõige kõrgema lahutusvõimega.

  27. Massianalüsaatorid Katood, U = 1...10 kV Anood, U = 0 V 2 Proovi kiirendatakse elektrivälja impulsi abil • Lennuaja MS (time-of-flight, TOF) Lahutusala Detektor Signaal 3 proov lahutub saadud kiirenduse mõjul vastavalt m/z suhtele: mida väiksem mass, seeda suurem on saavutatud kiirus (antud laengu korral) 4 Ühesuguse massiga ioonid jõuavad detektorini üheaegselt ja nende hulk on vastavuses mõõdetava signaali intensiivusega 1 Proov ioniseeritakse, saadakse M+ ioonid MALDI-TOF on kõige levinum MS meetod bioloogiliste proovide uurimisel

  28. MS: Võtmeaspektid • Meetodi avastamispiir on väga madal • Selektiivsus: erinev kõrge lahutusega (HR) ja madala lahutusega (LR) MS korral • LR-MS • sama nominaalse m/z väärtusega ioonide jooned on täielikult kattunud • Seetõttu on LR massispektromeetria enamasti kasutusel nii, et segudest on puhtad ained eelnevalt eraldatud: enamasti gaasikromatograafiliselt või vedelik-kromatograafiliselt • HR-MS • Sama nominaalse m/z väärtusega ioonide jooned on eristatavad

  29. HR Massispekter • Kõigi spektrilõigul nähtavate ioonide nominaalne m/z on 279!

  30. Brutovalem täpsest massist • Kui massispektromeeter on piisavalt suure lahutusega, siis võib täpne m/z anda peaaegu ühese brutovalemi. • Näide: nominaalsele massile 60 vastavad järgmised brutovalemid: C2H4O2, CH4N2O, C3H8O, C2H8N2. Kui oleks teada täpne mass 60.02, siis sellele vastab C2H4O2 • NB! Aine ei pruugi olla identifitseeritud isegi kui brutovalem on üheselt teada! Samale brutovalemile võib vastata palju ühendeid.

  31. Võtmeaspektid • Massispektri annavad põhimõtteliselt kõik ained • Puhaste ainete massispektrid on sageli küllaltki karakteristlikud ja sobivad seetõttu hästi ainete identifitseerimiseks • Ainete massispektritest on koostatud suuri andmebaase, mis on lisatud analüüsiaparaatide tarkvarale, ning millest tarkvara abil saab tundmatuid aineid otsida • Mõned ained siiski ei anna (elektron-ionisatsiooniga) karakteristlikke massispektreid, kuna fragmenteeruvad väga ulatuslikult

  32. Võtmeaspektid • Meetodi puudused: • Aparatuur on kallis • Aparatuur on õrn ja kapriisne, oskamatul käsitsemisel võib kergesti rikki minna • Aparatuur vajab asjatundlikku hooldust

  33. Massispektromeeter kromatograafias • Detektorina kromatograafilises süsteemis omab massispektromeeter eeliseid: • Kvalitatiivne info • identifitseerimine (andmebaasid) • kinnitus, et piik kuulub analüüdile • Kvantitatiivne • analüüs ainult ühe kindla massi alusel (SIC, EIC) • Selektiivne detektor – võimaldab analüüsi teostada ka siis kui ainete piigid on kromatograafiliselt lahutumata. • Mass-kromatogramm sisaldab kolmemõõtmelist informatsiooni: aeg, m/z ja intensiivsus.

  34. Massispektromeeter kromatograafias • GC-MS – gaasikromatograafia detektorina on massispektromeeter juba ammu rutiinkasutuses. • Kandegaasi hulk on väike, kuna kasutatakse kapillaarkolonne. • LC-MS – uus meetod. • Analüüsitavate ainete eraldamine eluendist on probleem, sest vedel keskkond ei sobi vaakumisse • Liides (ESI, APCI), mis tagab analüüdi jõudmise massispektromeetrisse ilma eluendita, on jõudnud piisavale tehnilisele tasemele alles viimase 15 aasta jooksul.

  35. Kirjandus • PRINCIPLES OF INSTRUMENTAL ANALYSIS Skoog D.A., Leary J.J. Fourth edition, Saunders College 1992 Skoog D.A., Holler F.J., Nieman T.A. Fifth edition, Harcourt Brace 1998 • PRINCIPLES OF BIOCHEMISTRY Lehinger A.L., Nelson D.L., Cox M.M. Second edition, Worth Publishers 1993 • Analüütilise keemia loengumaterjalid: http://tera.chem.ut.ee/~ivo/ak1/ak1_ms.pdf http://tera.chem.ut.ee/~ivo/ak2/ak2_ms.pdf

More Related