1.6

1. 12 24 36 12 12 12 12 24 24 24 24 36 36 36 36 Kontrolle Kontrolle Kontrolle Kontrolle 90% der Kontrolle 90% der Kontrolle 90% der Kontrolle 90% der Kontrolle Kontrolle AZT ddA ddI ddT A A 0 B B C C D D A B Zeit (d) 10.2 8.1 6.1 5.1 4.1 DNA-Länge (kb) 3.0 2.0 1.6 INHIBIERUNG DER VIABILITÄT VON PROSTATAKARZINOM-ZELLEN DURCH BEHANDLUNG MIT NUKLEOSIDANALOGA A. Schindler, U. Fiedler, J. Herrmann, M. P. Wirth Klinik und Poliklinik für Urologie, Technische Universität Dresden Einleitung Material und Methoden Telomerase, ein Ribonukleoprotein mit Reverse Transkriptase Aktivität befähigt Zellen ihre Telomerlängen zu stabilisieren und somit Seneszenz und Apoptose zu entgehen. Telomeraseaktivität ist in den Zellen der meisten maligne entarteten und hochproliferativen Geweben nachweisbar. Die Untersuchung von resezierten Prostatae mit histologisch gesichertem Karzinom ergab in 84% der Fälle stark positive Werte an Telomeraseaktivität (Sommerfeld et al. (1996)). Ihre Hemmung erscheint als Möglichkeit das Proliferationsverhalten von Krebszellen zu beeinflussen und könnte als alternative oder ergänzende Therapie beim fortgeschrittenen Prostatakarzinom Anwendung finden. Nukleosidanaloga, bekannt als Virostatika, können in neu synthetisierte DNA anstelle der natürlichen Nukleoside inkorporiert werden. Sie führen dann zur Kettenabbruchsreaktion und verhindern somit die DNA-Verlängerung. Angriffspunkte dieser Substanzen sind die DNA-Replikation (DNA-Polymerase) und die Regulation der Telomerlänge (Telomerase), wobei beide Mechanismen die Viabilität der Zellen beeinflussen können. Wir untersuchten in Langzeit-Tests den Einfluß von vier verschiedenen Nukleosidanaloga auf die Zell-Viabilität, die Telomerlänge und die Telomeraseaktivität der Prostatakarzinomzellinie DU145. Tetrazolium-Zellviabilitätstest: DU145 Zellen wurden in 100 µl BME Medium in 96-Lochplatten kultiviert und für 4 Stunden mit MTT-Reagenz (5 mg/ml, Boehringer Mannheim) inkubiert. Die Durchführung des Tests erfolgte nach den Angaben des Herstellers. Mit einem ELISA-Photometer wurden die Ergebnisse bei 570 nm quantifiziert (OD570). Bestimmung der maximalen subzytotoxischen Konzentrationen: Circa 5000 DU145 Zellen wurden in 96-Lochplatten ausgebracht und für 6 Tage in 100 µl Medium kultiviert, das AZT, ddA, ddI oder ddT in Konzentrationen von 0,49 bis 1000 µM enthielt. Am dritten Tag wurde das Medium erneuert, am 6. Tag erfolgte die Messung der Zellviabilität mit dem MTT-Test. Langzeitbehandlung mit Nukleosidanaloga: 500 DU145 Zellen wurden in 96-Lochplatten ausgebracht und über 33 Tage in Medium kultiviert, das 32 µM AZT, 16 µM ddA, 16 µM ddI oder 63 µM ddT enthielt. Jeden dritten Tag wurde mit dem MTT-Test die Viabilität in Vierfachbestimmung untersucht. Telomeraseaktivitätstest: Es wurde der auf dem TRAP-Assay basierende Telomerase PCR ELISA (Boehringer Mannheim) verwendet (Kim et al. (1994)). DU145 Zellen wurden in 25 ml Zellkulturflaschen in Medien kultiviert, die Nukleosidanaloga in o.g. Konzentrationen enthielten. Jeden 12. Tag wurden Zellen zu Durchführung des TRAP-Assays und der Telomerlängenbestimmung entnommen. Der Einsatz für jeden TRAP-Ansatz waren 100 000 Zellen, die in 100 µl Lysispuffer aufgenommen wurden. Telomerlängenbestimmung: Die DNA von bis zu 36 Tagen mit Nukleosidanaloga in o.g. Konzentrationen behandelten DU145 Zellen wurde mit dem OIAmp Tissue Kit (QIAGEN) extrahiert und über Nacht mit ALU I verdaut. Der Southern Blot wurde mit einer g-32P-markierten (TTAGGG)4 Sonde hybridisiert. Zusammenfassung Die Behandlung von DU145 Zellen mit den Nukleosidanaloga ddA und ddI führte ab dem 15. Tag zu einer signifikanten Hemmung der Zellviabilität. Eine Verringerung der Telomeraseaktivität wurde durch diese Substanzen nicht bewirkt, wie sich auch keine signifikanten Änderungen der Telomerlängen zeigten. Aufgrund dieser Ergebnisse ist anzunehmen, daß der viabilitätsinhibitorische Effekt von ddA und ddI eher durch eine Hemmung der DNA-Polymerase bewirkt wird. Die Untersuchung der Wirkungen von Kombinationen aus ddA oder ddI mit bekannten Chemotherapeutika auf Prostatakarzinomzellen könnte zu einer Verbesserung bestehender Therapieschemata führen. Es wäre weiterhin zu prüfen, ob Nukleosidanaloga in anderen Modifikationen eine höhere Affinität zur Telomerase aufweisen. Ergebnisse Es wurden vier Nukleosidanaloga gewählt, die in die telomere Sequenz (TTAGGG) inkorporiert werden können; AZT und ddT als Thymidinanaloga, ddA als Adenosinanalogon und ddI, welches anstelle von Adenosin oder Guanosin aufgenommen wird. Die maximale subzytotoxische Konzentration dieser Nukleosidanaloga in Kulturmedium einer DU145 Zellkultur wurde bestimmt (Abbildung 1). Da ein Einfluß auf die Viabilität durch die Hemmung der Telomeraseaktivität nicht innerhalb von 6 Tagen zu erwarten ist, muß eine Reduktion der Zellzahl durch direkte Zytotoxizität der Substanzen verursacht worden sein (Strahl et al. 1996 and Yegorov et al. 1996). Deshalb wurde die höchste Konzentration, unter deren Behandlung die Zellzahl nicht weniger als 90 % der Zellen der Kontrolle betrug als maximale subzytotoxische Konzentration definiert (rote Balken in Abbildung 1. AZT: 31,25 µM; ddA: 15,6 µM; ddI: 15,6 µM; ddT: 62,5 µM). Nukleosidanaloga in diesen Konzentrationen wurden in einem Viabilitätstest mit DU145 Zellen über 33 Tage untersucht (Abbildung 2). Eine signifikante Hemmung der Viabilität ist ab dem 15. Tag bei ddA und bei ddI behandelten Zellen zu verzeichnen (Student´s T-Test, zweiseitig, p£0,001; n=4); mit AZT und ddT zeigte sich keine Signifikanz. Der Einfluß der Nukleosidanaloga auf die Telomeraseaktivität wurde nach unterschiedlich langer Kulturdauer bestimmt und ist in Abbildung 3 A als Prozent der Telomeraseaktivität der Kontrolle dargestellt. Es zeigte sich, daß kein Nukleosidanalogon die Telomeraseaktivität signifikant supprimierte. Der Einfluß dieser Substanzen auf die Telomerlänge ist in Abbildung 3 B dargestellt. Die mittlere Länge der telomeren Restriktionsfragmente der Kontrolle von circa 3 kb wurde auch bei den nukleosidanaloga-behandelten Zellen bestimmt. Somit beeinflußt keines der untersuchten Nukleosidanaloga die Telomerlänge während einer Behandlungsdauer von bis zu 36 Tagen signifikant. Abb.2: DU145 Zellen wurden bis zu 33 Tage in Medien kultiviert, die mit Nukleosidanaloga in maximalen subzytotoxischen Konzentrationen supplementiert wurden (A: AZT, B: ddA, C: ddI, D: ddT). Die Kontrolle wurde in nukleosidanalogafreiem Medium kultiviert. Die Zellviabilität wurde aller drei Tage bestimmt. Die Daten entsprechen den Mittelwerten von Vierfachbestimmungen, deren Standardabweichungen durch die T-Balken dargestellt wurden. Abb. 1: DU145 Zellen wurden in Medium kultiviert, das Nukleosidanaloga in den aufgeführten Konzentrationen enthielt (A: AZT, B: ddA, C: ddI, D: ddT). Nach 6 Tagen wurde die Zellviabilität bestimmt. Die volle Linie zeigt die Viabilität der unbehandelten Kontrolle, die unterbrochene Linie 90% dieses Wertes. Rot hervorgehoben wurden die maximalen subzytotoxischen Konzentrationen, bei denen die Viabilität im Vergleich zur Kontrolle nicht mehr als 10% supprimiert wurde. Die Daten entsprechen den Mittelwerten von Dreifach-bestimmungen, deren Standardabweichungen durch die T-Balken dargestellt wurde. Abb. 3A: Telomeraseaktivität vom DU145 Zellen, die mit Nukleosidanaloga in maximalen subzytotoxischen Konzentrationen behandelt wurden. Die Telomeraseaktivität wurde am 12., 24. und 36. Tag der Behandlung bestimmt. Die Darstellung erfolgt in Prozent zur Telomeraseaktivität der nukleosidanalogafrei geführten Kontrolle. B: Untersuchung der Telomerlängenänderung derselben Zellpopulation unter Nukleosidanalogabehandlung. Die Abbildung zeigt den Southern Blot der telomeren Restriktionsfragmente (TRF). Zur Bestimmung der mittleren Länge der TRF wurde der Blot digitalisiert und ausgewertet. Die Mittelwerte von je zwei parallelen Bestimmungen wurden dargestellt. Literatur: Kim, N.W. et al., (1994). Science, 266, 2011-5. Sommerfeld, H.J. et al., (1996). Cancer Res, 56, 218-22. Strahl, C. & Blackburn, E.H., (1996). Mol Cell Biol, 16, 53-65. Yegorov, Y.E. et al., (1996). FEBS Lett, 389, 115-8.