第 1 章 DNA 重组克隆的单元操作

1. 第1章 DNA重组克隆的单元操作

2. 第一节 DNA重组的载体 作为一个理想的载体，应具备以下条件： （1）能够在宿主细胞中存在并繁殖，有功能良好的复制子和启动子，使插入基因复制和表达； （2）具有多个限制性内切酶的切点，且切点是单一的，这样可将多个外源DNA片段插入其中； （3）具有容易检测的筛选标记； （4）载体DNA的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片段，又可在受体细胞内扩增较多的拷贝； （5）在细胞内稳定性高，这样可以使重组体可以稳定传代而不易丢失。

3. 载体的种类： • 克隆载体（cloning vector）：主要是对目的基因克隆，建立DNA文库和cDNA文库，其上有复制子即可； • 表达载体（expression vector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，更要有强启动子； • 穿梭载体（shuttle vector）：这类载体可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。

4. 一、质粒 • (一) 质粒的分布、大小、数目 • 质粒广泛地分布于原核生物细胞中，也存在于某些真核细胞（酵母的2μ环状质粒）。 • 质粒DNA分子量范围为1—200×106Da。 • 一个细胞内的质粒数量变化也很大，有1至几个的，也有几十个的，甚至有数百个。 （这取决于质粒的复制类型。如果质粒的复制是严紧型的，每个细胞只有1个至几个质拉；如果质粒的复制是松弛型的，每个细胞中质粒有10-200拷贝数。）

5. (二)质粒DNA的构型 • 三种不同的构型： • 当其两条核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA(cccDNA)，这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型； • 如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA(ocDNA)。 • 若质粒DNA的双链均发生断裂而形成线形分子，则通称为L构型。

6. (三)质粒DNA的理化性质 • 质数DNA具有一般核酸分子的理化特性。 • 能溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂， • 在一定pH下可解离而带电荷 • 能吸收紫外线，可嵌入某些染料，如溴化乙锭。 • 比较能抗切割和抗变性。

7. (四)质粒DNA的生物学特性 (1)寄生性：质粒只能在宿主的细胞内复制。 (2)稳定性：每种质粒在宿主细胞中保持着一定的拷贝数。 (3)同源性：不同质粒之间可能存在一定的同源区。 (4)重组性：两种不同的质粒处于同一宿主细胞中或者一种质粒处于一种宿主细胞中，有可能发生质粒与质粒之间或质粒与染色体之间的重组。 (5)不相容性：有相同复制始区的不同质粒不能共存于同一宿主细胞中。该不相容性的分子基础主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。

8. (6)传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性的质粒带有一套与传递有关的基因。(6)传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性的质粒带有一套与传递有关的基因。 • (7)消除性：存在于宿主细胞中的质粒，可用某些办法将其去除。 • (8)复制类型：严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合成的严格控制，松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质合成的严格控制。 • (9)表现型：不同的质粒有不同的表型。如对抗生素的抗性等。

9. (五)质粒的命名原则 • 1976年提出一种质粒命名的原则，用小写字母p代表质粒，在p字母后面用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称。如pUC118, 字母p代表质粒，UC是构建该质粒的研究人员的姓名，118代表构建的一系列质粒的编号。

10. （六）组建理想质粒载体必须具备的条件 • (1)质粒拷贝数较高 • 质粒拷贝数是指生长在标准的培养基条件下，每个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。 • 严紧型：低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有1-3份的拷贝，称这类质粒为“严紧型”复制控制的质粒(stringent plasmid)； • 松弛型：高拷贝数的质粒，每个宿主细胞中可高达10-60份拷贝，这类质粒被称为“松弛型”复制控制的质粒(relaxed plasmid)。

11. (2)分子量较小 低分子量的质粒如下优点 • 通常拷贝数较高 • 克隆时所预期的基因表达产物的数量较大 • 限制酶的切点相应减少，有可能找到合适的单一限制酶切点，便于制作酶切图谱。 • 外源DNA容量较大， • 容易转化，当质粒大于15kb时，将成为转化效率的制约因素。 • 遗传工程操作时容易拿捏，容易分离，不易断裂。

12. (3)带有可供选择的标记 • 常采用的标记是对某种抗生素的抗性，如氨卞青霉素抗性(Ampr)、卡那霉素抗性(Kanr)、四环素抗性(Tetr)等，而且希望各抗性基因内有若干单一的限制酶切点。 • 在克隆时通过单一酶切点插入外源基因，使该抗性基因失活、宿主菌变为对该抗生素敏感的菌株，这样较易检查到克隆是否成功。 (4)带有尽可能多的单一限制性酶切位点(5)具有复制起始点(origin, ori)

13. （七）常用的质粒载体 • pSC101质粒载体是第一个成功用于克隆真核DNA的大肠杆菌质粒载体。 • pBR322是用人工方法构建的符合理想质粒载体条件的好载体，一度曾得到广泛的应用。 • (1)克隆载体

14. 重要的大肠杆菌质粒载体 pBR322： 松弛型复制 氯霉素可扩增 拷贝数 50 - 100 / cell 用于基因克隆

15. pUC质粒载体 (1)来自pBR322质粒的复制起点(ori)； (2)氨卞青霉素抗性基因(Ampr)，但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的限制酶的单识别位点； (3)大肠杆菌β-半乳糖苷酶(lacZ)的启动子及其编码该基因氨基端α-肽链的DNA序列,此结构特称为lacZ1基因； (4)多克隆位点(MCS)区段：位于lacZ 基因中的靠近5’端，内含十几个单一的限制性内切酶识别切割位点，使含有不同粘端的目的DNA片段可方便地定向插入载体中。但它并不破坏lacZ 基因的功能。

16. pUC18 / 19： 拷贝数 2000 - 3000 / cell 装有多克隆位点（MCS） 正选择颜色标记 lacZ’ 用于基因克隆和测序

17. pUC18质粒载体 • 优点: • (1)具有更小的分子量 • (2)便于重组子的检测 pUC18质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ’基因，所编码的α-肽链可参与α-互补作用。因此，在应用pUC18质粒为载体的重组实验中，可用X-gal显色法一步实现对重组子克隆的鉴定。 • (3)具有多克隆位点(MCS)区段

18. (2)表达载体 • 条件：一个强启动子及其两侧的调控序列; • 有SD序列且该序列与起始密码于ATG之间要有合适的距离 • 在克隆基因与启动子之间有正确的阅读框架；外源基因下游有转录终止子等。

19. pKK表达质粒载体 • pKK启动子为Ptac，由大肠杆菌强启动子Ptrp和Plac杂合组成。 • pKK233-3表达载体含有tac启动子、lacE的RBS、pUC18的多克隆位点，在远端还有一个rrnB的转录终止信号。 • pKK233—2，它的特点是RBS的下游8个核苷酸处有一个ATG序列，该ATG和它的前后核苷酸(CCATGG)一起又组成了Nco I位点，其后又有可供插入用的Pst I及HindIII位点，最后接上rrn B的转录终止信号。

20. 外源DNA可有3种插人法 ①将Nco I位点切开补齐后与外源DNA平端连接； ②如外源DNA亦含翻译起始ATG，Nco I位点则可直接连接，如为其他位点可加入Nco I接头后连接(使用8，10或12个核苷酸的NcoI接头以获得正确的读码框架)； ③使用Pst I或Hind皿位点，但此时会在表达蛋白的N-末端增加2-5个氨基酸。较新的表达载体是pKK388-I，它亦含有tac启动子及rrnB抗终止序列、RBS以及下游8个核苷酸处的Nco I位点，紧接着是来自pUCl8的多位接头，最后是rrnB的转录终止信号。

21. 融合表达载体系统 • 组成成分： 含有启动子(tac)及lac操纵基因、 SD序列 谷胱苷肽巯基转移酶(GST)基因，而克隆的外源基因则与GST基因相连。当基因表达时，表达产物为谷胱苷肽巯基转移酶与目的基因的融合体。

22. 该载体具有以下优点： ①可诱导，能高效表达所需基因或基因片段。IPTG可诱导tac启动子进行高效表达。 ②融合蛋白极易纯化。谷胱苷肽巯基转移酶GST分子量为25kDa，作为一种酶在大肠杆菌表达或与外源基因融合表达时，与自然界存在的酶具有相同的酶活性，用亲和层析法(G1utathione Sepharose 4B)极易从裂解液中分离纯化出融合蛋白，也可用显色法或免疫学方法方便地检测外源蛋白的表达量。 ③可方便地从融合蛋白中获取单一外源蛋白。

23. QIAexpress 6×His表达系统 • 该系统为Ni-NTA基质对带6个组氨酸残基的重组蛋白质具有亲和层析的高效原核表达系统， • 优点：①6×His比其它标记更小，可用于任何表达系统，包括酵母、杆状病毒和哺乳动物细胞表达系统，不影响蛋白质的结构和功能，无需蛋白酶把6×His切除。②生理pH条件下6×His不带电荷，所以不影响蛋白质的分泌。③因5×His免疫原性差，所以无需去除6×His, 重组蛋白可直接用作抗原产生所需抗体。

24. 二、λ噬菌体 • λ噬菌体是感染大肠杆菌的溶源性噬菌体，在感染宿主后可进入溶源状态，也可进入裂解循环。 • 基因组长度：约为50kb的双链DNA分子，实际大小为48502bp。 • DNA是线状双链分子带有单链的互补末端，末端长12个核苷酸，称为粘性末端，简写cos，12个碱基的序列为5'-GGGCGGCGACCT-3'。当噬菌体感染宿主细胞后，双链DNA分子通过cos而成环状。

25. CCCGCCGCTGGA GGGCGGCGACCT 环化作用 G T C A

27. 基因组分为几个不连续的区域，三个片段组成：基因组分为几个不连续的区域，三个片段组成： • （1）左臂，19.6kb，含噬菌体头、尾蛋白质编码基因，A～J的12基因都是构成外壳蛋白的基因，其中A～E5个基因与头部形成有关，G～J5个基因与尾部形成有关。 • 噬菌体左右两臂包含了λ复制和成熟所必须的全部机能蛋白编码，而中央片段为非必需区，即位于J基因和N基因之间的片段可被其他大肠杆菌DNA片段所替换。

28. （2）中央片段，12kb～24kb，含PL控制red和gam基因。（2）中央片段，12kb～24kb，含PL控制red和gam基因。 非必需区

29. （3）右臂，9kb～11kb，含λDNA复制和溶菌有关的蛋白编码基因。与裂解有关的S和R基因、与DNA复制有关的O基因和P基因等也都分别聚集在一起。（3）右臂，9kb～11kb，含λDNA复制和溶菌有关的蛋白编码基因。与裂解有关的S和R基因、与DNA复制有关的O基因和P基因等也都分别聚集在一起。 非必需区

32. λ噬菌体的缺陷与改造 λ噬菌体的缺陷： ⑴ 基因组太大（49kb）； ⑵ 酶切点太多，它有5个BamH1位点（G↓GATCC），6个BgⅠ位点（A↓GATCT），5个EcoRⅠ位点（G↓AATTC）。 ⑶野生型只能接纳一定长度的DNA。若相当于λ噬菌体的75-105%，那么只能接纳49kb×5%=2.45kb的DNA。 λ噬菌体的改造 ⑴ 切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（2.5kb或更大）； ⑵ 去处太多的酶位点，每种酶只留1-2个切口； ⑶增加标记基因（remarke gene）。 (4)引入无义突变．

33. 野生型噬菌体具有大而复杂的基因组，必须经过改造才能用作载体：野生型噬菌体具有大而复杂的基因组，必须经过改造才能用作载体： • ①现在用的λ载体大都减少或增加某些限制性内切酶的酶切位点：野生型有65种限制酶酶切点，除ApaⅠ、NaeⅠ、NarⅠ、NheⅠ、Sna BⅠ、XbaⅠ和XhoⅠ等7种限制酶各有一个切点外，其余都多于2个。有些酶切点在λ增殖所必需的基因区域内。 • ②将λ噬菌体的非必需区做部分切除 • ③插入了某种报告基因

34. 1.λ噬菌体载体的类型 • 两种类型： ①置换型 ②插入型 置换型载体：可被外源DNA置换的λ噬菌体非必需区两侧有一对限制性酶切位点的载体，称为置换型载体。 插入型载体：有一类只含一个限制性位点可供插入外源DNA的载体，这类λ噬菌体载体称插入型载体。

35. λ噬菌体载体是主要用于cDNA文库构建，也经常用于外源目的基因的克隆。λ噬菌体载体是主要用于cDNA文库构建，也经常用于外源目的基因的克隆。 注意：λ噬菌载体作为载体，其重组噬菌体DNA大小只能： 38kb ~ 52kb。 体外包装：λ噬菌载体 + 尾部蛋白 + 头部蛋白

36. 三、柯斯质粒 • 1978年Collins和Hohn构建一种新型的大肠杆菌克隆载体，命名为cosmid(柯斯质粒)，又叫粘粒。 • 柯斯质粒（cosmid）= cos序列+质粒。 实际是质粒的衍生物，它是用正常的质粒同λ噬菌体的cos位点构成。

37. 1.粘粒的组成及性质： • 它的大小一般 5-7kb 左右，用来克隆大片段 DNA 克隆的最大 DNA 片段可达45kb • ①质粒复制起点（colE1） 象质粒一样转化和增殖 • ②抗性标记ampr • ③ cos位点 • ④有的粘粒载体含有两个cos位点

38. cos site - carrying plasmid BamHI l-DNA cos序列和质粒复制子的 Tcr PstI Apr SalI 1.8 kb的l-DNA片段 + pBR322片段 pHC79 6400 bp 装载范围为31 - 45 kb ori l fragment cos

39. 2.柯斯质粒pHC79系 • 由质粒pBR322和λ噬菌体的cos位点的一段DNA构成，全长43kb。 • 在包装时，cos位点打开而产生λ噬菌体的粘性末端。由于pHC79有pBR322DNA，所以也就有氨苄青霉素抗性和四环素抗性两个标记。 • 凡具有cos位点的任何DNA分子只要在长度相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似λ噬菌体的颗粒。 • 因此，插入柯斯质粒的外源DNA可大于40kb。重组的柯斯质粒可象λ噬菌体一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。如把宿主菌在含氯霉素的培养基中生长，柯斯质粒可以扩增到宿主细胞DNA总量的50%左右。

40. 3.柯斯质粒有以下优越性： • ① 能象λ-DNA一样体外包装，并高效导入受体细胞； • ②可以装载比质粒或λ-DNA大得多的外源DNA片段，如cos区及附近顺序长为1.7 kb，质粒长为3.3kb，则该柯斯质粒最大可装载46.5kb的外源DNA； • ③ 由于携带质粒的选择标记，便于筛选； • ④ 由于质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。

41. 常用的粘性粒有PHC79、PJB8、MUA-3和KOSI等，它们大多具有一种或多种限制性内切酶的单一酶切位点。采用这种大容量载体不仅可减少构建基因组DNA文库的重组克隆数目，减少工作量，提高筛选时的阳性检出率，而且极其适合高等真核基因的克隆工作。常用的粘性粒有PHC79、PJB8、MUA-3和KOSI等，它们大多具有一种或多种限制性内切酶的单一酶切位点。采用这种大容量载体不仅可减少构建基因组DNA文库的重组克隆数目，减少工作量，提高筛选时的阳性检出率，而且极其适合高等真核基因的克隆工作。

42. 4.采用柯斯质粒作载体的困难 • ①载体易自身连接。可用碱性磷酸酶处理，可阻止载体分子自身连接； • ②大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子。 • ③细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯斯质粒制备基因文库，则筛选所需的含某一DNA片段的菌落很费时间。

43. 四、M13 噬菌体载体 • 单链DNA噬菌体是一类丝状的大肠杆菌噬菌体，由单链环状DNA分子外面包裹上一层蛋白质外壳而成。 • M13噬菌体是单链DNA噬菌体中的一个典型的代表。

44. 1.M13噬菌体的组成和结构 • M13噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。 • 2700个外壳蛋白分子

45. 2.M13噬菌体的基因组 • 单链DNA，由6407碱基组成。 • 90%以上的序列可编码蛋白质，共有11个编码基因 • 基因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因Ⅷ和基因Ⅲ以及基因Ⅱ和基因Ⅳ之间，其间有调节基因表达和DNA合成的元件。 • 编码3类蛋白质： ①复制蛋白（基因Ⅱ，Ⅴ和Ⅹ） ②形态发生蛋白（基因Ⅰ，Ⅳ和Ⅺ） ③结构蛋白（基因Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ）

46. 3. M13噬菌体载体的构建 M13噬菌体作为载体具有几个重要的特点： ①M13噬菌体的感染与释放不会杀死宿主菌，仅导致宿主菌生长缓慢； ②M13噬菌体DNA在宿主菌内既可以是单链也可以是双链，通过感染或转化的方法能将M13噬菌体DNA导人宿主菌中； ③M13噬菌体的包装不受DNA大小的限制，其噬菌体颗粒的大小可随DNA的大小而改变，即使DNA的大小比本身DNA的大小超出6倍，仍能进行包装。 ⑤M13噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的RF DNA：单链DNA的酶切和连接是比较困难的。 ⑥外源片段插入位点在基因Ⅱ和基因Ⅳ之间的508bp间隔区----M13不像λ噬菌体基因组那样含有较大的可替代区。它的基因组中绝大多数为必需基因，只有两个间隔区可用来插入外源DNA（基因Ⅱ/Ⅳ和基因Ⅷ/Ⅲ之间）。

47. mp系列载体 • M13mp载体系列是由M13mp1改造而来的，M13mp1在IR区内插入了一个编码β-半乳糖苷酶N端146氨基酸的基因序列 • 当选用含有F’因子的β-半乳糖苷酶基因缺陷突变体作为宿主菌时，由于该缺陷型基因编码的多肽缺失N端第11－41位氨基酸，因此缺陷型的β-半乳糖苷酶没有生物活性 • 未插入外源基因的M13mp1与该缺陷型基因可以产生互补作用，常称为α互补。

48. M13mp18 和 M13mp19 • 这两个载体含有 13 个不同的酶切位点，可供插入由多种各不相同的限制酶切割而成的 DNA 片段，这两种载体只是在 lacZ 区内不对称的多克隆区的方向上有所不同。 • 当RF DNA被两种不同的限制酶切割以后， M13mp18 和 M13mp19 轻易不能重新环化。仅当连接混合液中含有带匹配末端的外源双链DNA片段时，方可闭合成环。

49. 这一片段在 M13mp18 和 M13mp19 中将以两个互为相反的方向插入。这样一来，在 M13mp18 的正链中含有外源 DNA 双链的其中一条链，而在 M13mp19 正链中则含有外源 DNA 的另一条链，即 M13mp18 重组体的子代噬菌体内含有外源 DNA 的一条链，M13mp19重组体的子代噬菌体内则含有它的互补链。 • 故用 M13mp18 和 M13mp19 作为一对载体，就可能用一个引物（通用引物），从所插入 DNA 片段的任一端开始，测定互为相反的两条链的 DNA 序列，并可制备只与外源DNA的任意一条链互补的DNA探针。

50. M13噬菌体产生单双链DNA的机制： 1、以（+）链DNA为摸板，合成互补（－）链，该双链称复制型DNA（RFDNA）。 2、RFDNA在宿主细胞内能快速增殖，可增加到每个细胞约200个拷贝。 3、单链特异的DNA结合蛋白结合在（+）链上，从而阻断了其互补链，即（－）链的合成，这样，细胞就会不断的合成（+）链DNA 。 4、游离出来的（+）链DNA先与基因V的编码产物形成特异的DNA-蛋白质复合物，然后转移到寄主细胞膜，同时基因V的蛋白质从（+）DNA链上脱落下来，余下的M13（+）链DNA则是从其感染的寄主细胞的细胞膜溢出的过程中，被外壳蛋白包装成病毒颗粒的。