초고속 광학기술 기반의 나노 바이오 기술 : DNA 분석 , 전기화학 센서 , 그리고 단일세포 연구

1. 2011년 대한기계학회 포항지회 추계학술강연회 초고속 광학기술 기반의 나노 바이오 기술: DNA 분석, 전기화학 센서, 그리고 단일세포 연구 Ultrafast optical ablation for nano/bio technologies : DNA sequencing, electrochemical detection, and single cell manipulation SANGHYUN LEE, Ph.D. CEO in the Femtofab Co. Ltd. Research Professor in the POSTECH

2. CONTENTS • Section 1 introduction to femtofab co. Ltd. • Section 2 Ultrafast optical science • Brief history & background of UFOS • Pre-Femtofab Technologies • Section 3 POST-femtofab • Post-Femtofab Technologies • Femtopore DNA sequencing • Thin-Film Nano-Electrodes: nano-sensors & nanobots • Single cell analyses: nCE, bio-drug • sUmmary

3. Section 1 Introduction to Femtofab Co. Ltd.

4. 1. 일반현황 Section 1. 회사 개요

5. 2. 연구개발연혁 Section 1. 회사 개요 • 2010.05 : 나노유리전극 및 세상에서 가장 작은 펌프 개발: Nature Nanotech. 논문 출판 (이상현 박사 제1저자), BBC news, Nature news, Popular Science등 전 세계 50 여 개 미디어에서 소개 • 2010.11 : 펨토초 레이저 가공 기반의 박막금속나노전극 특허 출원 (발명, 출원: 이상현) • 2010.12 : “Femtofab” 상표 등록 (이상현) • 2011.04 : DNA sequencing을 위한 나노 포어(FemtoPore) 가공법 특허 출원 (발명, 출원: 이상현) • 2011.02 : 지방흡입시술 중 혈중 지방 유입도 측정 기법 개발: 특허 출원 및 진단 장치 개발 중 • 2011.06 : 중기청 예비 창업자 과제 선정 (9 천 만원): 액적 기반 진단 장치 상용화 • 2011.07 : 주식회사 펨토펩 설립 (대표이사 이상현) • 2011.07 : “FemtoPore” 상표 등록 (이상현) • 2011.07 : 삼차원 액적 측정 및 표면 장력 측정 기법 개발: 특허 출원 및 측정 장치 상용화 추진 중 • 2011.08 : 포항 TP 기술지원 선정 (2 천 만원): 펨토초 레이저 가공 설비 추진 • 2011.09 : 대통령 포스닥펠로우쉽(7억 5 천 만원/5년): 초고속 광학기술기반 나노/바이오 기술 선도 • 2011.10 : 포스코신사업 아이디어 공모 기업부문 최우수 선정 • 2011.10 : 나노 전극 및 나노포어 가공 특허 PCT 출원

6. 3. Femtofab삼차원 나노 가공법 Section 1. 회사 개요 1990년대 펨토초 레이저 가공법 회절 한계 극복 2004 년 펨토초 레이저 나노 가공법 PRE-FEMTOFAB 유리 나노 전극 개발 가공 깊이 한계 극복 2010 년 초 Pre-Femtofab 가공법 미세 가공 기술 POST-FEMTOFAB Femtofab삼차원 나노 가공법 개념 정립 박막 금속 나노 전극 가공법 터널링나노포어 가공법 Feature size Femtofab protocol I Femtofab protocol II 유전자 분석 기술의 상업화에 가장 큰 난제인 DNA의 절단, 증폭, 재조합 과정이 필요치 않는 nanopore sequencing의 구현 2011 년 pre-femtofab시기의 기술들을 상업화시키는데 가장 큰 난제였었던내부 나노 전극 형성을 실현 Spot Size

7. 4. 사업화 목표 Section 1. 회사 개요 FemtoPore를 세계 최초로 독점 개발하여 개인 유전자 분석 시장을 상업화 하는 것. • FemtoPore란긴 나노 채널 내부에 나노 전극을 포함한 3차원 나노포어 • (수 나노 미터 크기의 구멍)를 말하며, 이 포어로DNA를 통과시키면서 나노 전극간 터널링 전류의 측정을 통해 염기서열을 빠르고 정확하게 분석함 (DNA분석) Conterders of business 기존 기술 개발 방향 노벨상수상 (1993 년) 기술인 Polymerase Chain Reaction (PCR)은 1983년 Kary Mullis 에 의해 개발된 유전자 증폭 기술로 인간의 염기서열의 분석을 가능하게 해준 기술 높은 가격과 오랜 분석 시간 등 근본적 제약 인해 연구 개발 시장 (~ 2 조원/년)에 국한됨. Femtopore는 삼차원 펨토초 나노 가공법 기반의 나노포어이며, 싼재료를 사용하고, 가공비가 저렴하며, 가공변수가 적고, 가공의 정확도가 높으며, 가공 시간이 빠름 • FemtoPore를통해 1000$ 이하의 개인 유전자 분석 기술을 실현하고, 수백조원이 넘는 개인 유전자 분석 시장을 개척하고 주도하는 것이 궁극적 신 기술 개발 사업의 목표임.

8. Section 2 Ultrafast Optical Science Pre-Femtofab

9. Brief History of Ultrafast Optical Science Femtochemistry • Rudolph A. Marcus (Nobel Laureate, 1992) • : electron transfer reactions in chemical system • Ahmed H. Zewail (Nobel Laureate, 1999) • : Femtochemistry: atomic-scale dynamics • of the chemical bond using ultrafast lasers Application fields 1. Femtosecond spectroscopy 2. Inertial confinement fusion 3. Nonlinear optics 4. Fs-laser machining 5. Two-photon microscopy And more …… Femtosecond spectroscopy * From the Nobel Lecture by Ahmed H. Zewail “Femtochemistry,” 1999.

10. Time Scales of Physical Systems * From the Nobel Lecture by Ahmed H. Zewail “Femtochemistry,” 1999.

11. Time Scales in Light-Matter Interaction Light matter interaction according to pulse duration Ultrafast optical science in fs-regime 1 ps 1 ns 1 μs • For 100 fs: light travels 30 μm! Photon-electron coupling time Avalanche-ionization Ablation Two-photon microscopy UV-like solidification Heat diffusion time scale (ep> 1012 W/cm2) (ep < 109W/cm2) Fs-laser nanomachininig • No collateral thermal damage • Collateral thermal damage • Deterministic damage threshold (<1%) • Stochastic damage threshold (50%) • Diffraction limit • : resolution > λ/2 • | • shorter wave length! • : UV, X-ray, …… • Resolution << λ/2, what limits resolution? • Diffusion of ionized electrons • - Valence electron density (de) • - Skin depth, δ<<λ @ de >1021 • - Diffusion of ionized electrons ≈10 nm Breakthrough! *A.P. Joglekar, et. al., Appl. Phys. B, 2003 and PNAS, 2004

12. Feature size Feature size Energy Spot Size Beam waist Non-Linear Multi-Photon Phenomena Single-photon vs. multi-photon absorption Optics at critical intensity

13. Feature size of Fs-Laser Nanomachining Surface nanomachining down to 30 nm Sub-surface nanomachining down to 100 nm, typically 600 nm A.P. Joglekar, et. al., Appl. Phys. B, 2003 and PNSA, 2004 & K. Ke, E.F. Hasselbrink, and A.J. Hunt, Anal. Chem. 77, 2005

14. PRE-FEMTOFAB: Monolithic NanofluidicDevices • Monolithic fabrication process with transparent dielectrics • Nanochannel-based fluidic networks • Major acomplishments • Extending machining length/depth 20 times longer • Invention of nano liquid glass electrode & cell-size nano-devices Cell-size nano-devices nCE EK pump • Channel length : 850 µm • Diameter : 600 nm • Aspect ratio : 1400

15. Loading channel ~ 120μm Separation column Microchannels in PDMS header Detection area PRE-FEMTOFAB: Nano-Capillary Electrophoresis (nCE) Geometry of nCE separation device • Applications to in statu quo biochemical analysis • Lysis-free single cell analysis • Implant CE analyzer for physiological monitoring

16. PRE-FEMTOFAB: nCE for single cell analysis without cell-lysis Lysis-free single cell analysis - Analysis volume per test: 1-10 fl - No sample waste - Cell volume: 1 pl – 1 nl - Volume fraction: 103 – 106 • Single cell analysis without cell lysis: • Real time monitoring of cytosolic contents such as enzymes and hormones for entire life time of the cells • Cell response to external stimuli (mechanical, electrical, optical, and chemical) • Production of important proteins, hormones, and enzymes: biomedicine?

17. PRE-FEMTOFAB: nCE for implant patho-physiological monitoring Implant CE analyzer for (patho-) physiological monitoring 32-gauge needle • Ovulation • Fertility • Diabetes Mellitus • Parkinson’s • …… 1. Cell-size footprint of nCE Minimizes ; foreign body discomfort1and blockage2 in vascular system 2. Rapid subsecond analysis with low potential reduces ; electric shock1test time2 and power consumption3 3. Negligible sample and buffer consumption (fl per test) provides ; long-term1maintenance-free2 operation without adverse effects3 (under diverse CE modes)

18. PRE-FEMTOFAB: Liquid Glass Electrode for Nanofluidics, Nature Nanotech. Semi-conductor-like electrical behavior of the nano-scale glass tip Nano-scale wall Nano-capillary High field current conduction: Zener-diode model Pmax Patm Pmin * Nature nanotechnology (IF=26.3), featured paper of the issue (Vol.5, 2010)

19. PRE-FEMTOFAB: Thermal characteristics of NLGE Electrical and thermal characteristics of the NLGE: COMSOL

20. PRE-FEMTOFAB: NLGE-based EK-pump Single RBC-size nano-injector: smallest man made pump de novo

21. PRE-FEMTOFAB: Media Press Introduced in world wide media more than 50

22. Section 3 POST-FEMTOFAB

23. POST-FEMTOFAB TECHNOLOGIES Femtofab achieves complex 3D-nano devices based on the fs-laser 3D nanofabricaion combined with conventional micro-lithographical processes. Femtofab (newly coined) Fs-laser-pulse 기반공정 Lithography 기반공정 • 3-D exterior: > 40 nm • 3-D Interior: > 150 nm • Single nanopore: > 60 nm • True 3-D • Nano-scales • Fusion or hybrid • Mass production • Wide area coverage • Composite (multilayer) Thin film nanoelectrode FemtoPore Metal-based TFNE FemtoPore for DNA sequencing Two electrode types (NLGE & TFNE) Femtofab Protocol I Femtofab Protocol II

24. Femtofabprotocol I 센싱기술 응용제품 ■ 생화학 분석 장비용 전기화학 센서 모듈 • 레이저 기반의 형광 기법, UV 검출 기법 • - 고가의 광학 장비가 요구되며, 부피가 커 소형화에 어려움이 있음. • - 진단 체적이 작아질수록 민감도가 급격히 하락. • - 세계적으로 4 천억원 정도의 시장 형성 • 전기화학 센서 • - 금속 전극만으로 이루어져 구조가 간단하고 사용이 쉬우며 소형화에 유리. • - Femtofab protocol I은 나노 채널과 나노 전극을 동시에 가공/형성해 줌. • - 전기화학 센서는 소형 분석기기에서는 기존이 형광 기반 센서를 대체할 수 있으며, 중대형 장비에서는 형광 센서와 동시에 사용되어 분석의 정확도를 더욱 향상시킬 수 있어, 다양한 시장 진출 기회가 있음. Fig.1. LIF (Laser induced fluorescence) 기반의 센싱 기법 Fig.2. 밀리미터 수준의 전기화학적 센서. Fig.3. Femtofab protocol I에 의한 나노 스케일 전기화학적 센서

25. Femtofabprotocol I 센싱기술 응용제품, 계속 ■ 전기화학 센서 일체형 모세 분리관 모듈 • 모세 분리관내경이 수 마이크로까지 점점 작아지는 추세임. • 전기화학 센서 모듈의 경우 기존의 모세 분리관과의 결합 부분에서 결함 및 분리도 하락의 요인이 있을 수 있음. • 따라서, 모세 분리관의끝단에 전기화학 센서를 내장한 일체형 제품이 보다 쉽게 시장에 진출할 가능성이 큼. • 시중에 다양한 모세 분리관이 있으므로 종류에 상관없이 전극을 쉽게 이식하는 기술의 개발이 요구됨. • 일체형 모세관의 경우, 기존의 형광 계측 기법과의 융합이 구조적으로 유리하여 중대형 분석 기기의 분리도 향상 기대. Fig.1. 분석화학 장치에 쓰이는 모세 분리관. 기존의 모세 분리관에 전기화학 센서를 내장한 일체형 분리관 개발. Fig.2. 미세 유체칩의 형태로 제작된 모세 분리관. 미세 유체칩 내부에 전기화학 센서를 내장한 형태로 제품 개발.

26. POST-FEMTOFAB: TFNE for electrochemical nanosensor & nanoactuators TFNE-based EK nanosensor NLGE TFNE Nanobot : Single blood cell-size robots traveling through blood vessels D < 10 μm Nanobot thrust!

27. Femtofabprotocol I 펌핑기술 응용제품 ■ 미세 유체칩 구동용 초소형 펌프 • 경쟁/기존 기술: 주사기 기반의 펌핑 시스템으로 미세 유체칩 외부에 장착. 부피가 크고 무거우며 고가임 • 전기운동학 펌프의 경우 moving parts가 없어 초소형화에 적합하나 전극, porous membrane 등을 미세 유로 내부에 집적하는데 큰 어려움이 있어 mm 스케일 이하로 소형화하는데 어려움. • 회사는 유리 나노 전극 기반의 극초소형 펌프(5 마이크로)를 세계 최초로 개발하였으며, Femtofab protocol I 을 통해 유리 나노 전극을 박막 금속 전극으로 대체, 펌핑 성능이 10 배 이상 높은 극초소형 EK 펌프의 개발을 추진 중임. • 극초소형 펌프는 미세 유체칩에 직접 장착할 수 있고, 또한 칩 제조 공정 중 내부에 이식하는 것이 가능하여, 지금까지 구현이 어려웠었던 미세 유체칩의 개발에 결정적인 역할을 할 것으로 기대 Fig.1. 주사기 기반의 syringe pump 예 Fig.2. Moving parts가 없는 전기운동 펌프 원리 Fig.3. 초소형 전기운동 펌프를 미세 유체칩에 직접 장착

28. Femtofabprotocol I 펌핑기술응용제품 ■ 능동형 항암제 전달체 • 경쟁/기존 기술: 항암제 전달체는 다양한 기술들이 개발되고 있으며, 모두 수동적으로 동작함. 항암제 전달 방식은 혈류를 따라 가며, 카테터 등으로 암조직 근처에서 혈관을 따라 주입함. 색전 효과와 함께 독소루비신 등의 항암제를 암조직에 투약하는 기능을 추구함. • EK 펌프 기반의 능동 추진 입자체에 항암물질을 로딩하며, 혈관을 따라 능동적으로 암조직에 접근. 또다른 극초소형 펌프 (5 마이크로)를 사용하여 암 조직에만 항암제를 능동적이고 차별적으로 투여함. • 능동형 전달입자의 경우 투약 후 수거하여 재 사용이 가능함. 따라서 많은 입자를 투입하지 않고, 소수의 입자를 계속 순환하면서 지속적으로 항암제 투약하는 방식이 가능할 수 있음. 추진 Pump 항암제 Pump Fig.1. 카테터를 사용하여 암 조직 근처의 혈관에 색전 입자 또는 항암 입자 삽입. 추진 Pump Fig.2. 극초소형 펌프로 추진을 하며, 또다른 펌프로 항암제 투여. 전체적인 크기는 조절가능함.

29. POST-FEMTOFAB: Lab-in-a-cell (LIC) • FemtoFab can meet the structure scales required in the LIC research. LIC is within reach! NLGE-based nano-injector 4 μm Sperm (head: 3-4 μm) Vesicle Erythrocyte: 5-7 μm (hypertonic) Activated thrombocytes • Lab-in-a-cell (LIC) concept • 106 ATP/s & 104 proteins/s • LIC=LOC with a cell at core • Cell characterization • Protein production • * Albert van den Berg, Current Opinion in Biotechnology, 2004 Leukocyte: 5-7 μm (T-lymphocyte) Monocyte • Submicron scale • Nano-electrode • 3-dimensional Oocyte (~120 μm)

30. FemtoPore Innovative fs-NT for nanopore sequencing

31. POST-FEMTOFAB: PCR & Human Genome Project • PCR (Polymerase Chain Reaction:Kary Mullis, 1993년 노벨상 수상)의 발명이후 Human genome project를 통해 인간 유전자 분석이 완료되어 (92.7%) 인간은 자신의 설계도인 유전자 지도를 갖게 됨. • 인간의 탄생과 죽음, 질병의 원인, 노화 등을 푸는 근본적인 열쇠를 제공. • 인간의 유전자 배열은 개인간 매우 유사하나, 염기서열 한 쌍의 차이만으로도 질병의 양상이 달라짐. 따라서, 개인의 고유 유전자 배열을 아는 것이 무엇보다 중요함. • 수 조개의 세포 • 46 개의 염색체 • 30 억 개의 base pairs • 8 만 개의 genes • Proteins performing all life functions

32. POST-FEMTOFAB: Personal DNA Sequencing • 개인 유전자 분석이 1000$ 이하로 가능할 경우 큰 상업 시장 (~1000 조원/년)이 열릴 것으로, 미국을 중심으로 선진국의 연구 역량이 가장 크게 집중되고 있음. • 하지만, 유전자 분석을 실현시킨 유전자 증폭 기술 (PCR)은 긴 분석 시간, 높은 분석 가격 등 때문에 개인 유전자 분석을 상용화시키는데 역부족임. • 이에, PCR방식에서 필수인 유전자 절단, 증폭, 및 재조함 과정이 없이 염기서열을 직접 읽어들이는 신 분석 방법의 개발이 절실함. DNA 추출 DNA 절단및 증폭 (< 800 bp) Sequencing (gel-EP) 재조합 (수퍼컴 기반)

33. POST-FEMTOFAB: Nanopore Sequencing Nanopore sequencing • PCR은 인류 역사상 가장 위대한 발견 중 하나이나, 긴 분석시간과 높은 가격으로 1000불 이하의 유전자 분석이 매우 어려움. • 1000불 이하 유전자 분석법을 실현시켜줄 것으로 nanopore sequencing 이 기대를 모으고 있는데, 이는 DNA의 절단, 증폭, 재조합 없이 DNA가 직접 nanopore를 지나가게 하여 이때 생기는 전류의 변화를 측정하여 염기서열을 분석하기 때문이며, 이러한 direct DNA sequencing 방법 중 분석 가능성이 증명된 방법임. • 최근, 나노포어 내부에 나노 전극을 설치하여 터널링 전류를 측정하는 방법이 측정 민감도를 1000배 이상 높여줌이 밝혀져 상용화 가능성을 크게 높였음. • 일반적인 개념은 나노포어를 통해 흐르는 전류의 전도도 변화가 DNA의 기본 단위인 A, C, G, T에 대해 다르게 생기는 현상을 이용함. • 하지만, 나노포어를 가로지르는 나노 전극을 설치할 경우 나노포어를 통해서 흐르는 전류의 전도도 변화에 비해 1000배 가량 큰 전류 변화를 유도할 수 있음이 밝혀져, 상업화의 가능성을 크게 높였음. 이에, 나노포어 내부에 나노 전극을 설치하는 기술의 중요성이 크게 대두됨. US 6,905,586 B2 (Jun. 14, 2005)

34. POST-FEMTOFAB: Oxford Nanopore Technologies and others • Oxford 대학의 Hagen Bayley교수가 2008년 설립 (fund raising800억 이상 유치) • 다양한 특허의 라이센싱 및 출원을 통해 250개의 특허 확보 추진 • α-hemolysin 천연 포어와 Solid State Nanopore 를 중심으로 상업화 추진 • IBM에서는 DNA의 나노포어 통과 속도 제어 연구 추진 • 최근 graphene을 나노 전극으로 사용하는 방법이 네이처지 표지 장식 IBM DNA Chip Graphene Nanopore (Harvard Nanopore Group) Oxford nanopore technologies Co. Harvard nanopore group

35. POST-FEMTOFAB: FemtoPore • Femtosecond-laser-based 3D nanofabrication 공법으로 가공된 인공 nanopore. • 현재, 나노포어 가공법 및 나노 전극 가공법이 특허로 출원되었음. • 나노포어의 가공은 1000$ 이하 개인 유전자 분석 시장의 핵으로 떠오른 nanopore sequencing 분야의 핵심 키워드. Fs-nanofabrication Femtopore with nanoelectrodes 500nm Tunneling currents • 두 개의 500 nm 지름의 나노 채널 끝단이 100 nm 정도로 서로 근접하게 되면 유리 나노 전극이 형성됨 (네이처 나노테크놀로지 발표). • 두 나노 채널을 더욱 접근 시키면 서로 맞닿아 작은 나노 포어가 형성됨. • 이 때, 미리 형성해놓은 금속 패턴 중앙에서 두 나노 채널이 맞닿게 하면 나노 전극이 동시에 형성됨. 500nm channel ROK Patents 10-2011-0044900 & 10-2010-0108008

36. POST-FEMTOFAB: Femtopore vs. Solid-state nanopore A femtopore btw nanochannels with electrodes Nanopores on broad flat surface w/o electrodes • New nanopore based on glass • Low price • Electrically & chemically stable • Optically visible • Nanopore inside long nanochannels • No multiple DNA access • Including DNA stretching • Nanopore with nanoelectrodes • Tunneling currents (1000x signal) • Conductivity + permmitivity • Nanopores on silicon (ion-beam sculpture) • Pore size down to ~ 2 nm • Structurally stable • Mass-production • Multiple DNA access • Natural nanopores on cell membrane • Proved DNA sequencing • Poor stability • Difficult to systemize • Low S/N: ensemble-averaging (slow)

37. POST-FEMTOFAB: Femtopore Sequencing Femtopore with nanoelectrodes Tunneling currents * Harvard nanopore group • Femtopore sequencing without nanoelectrodes • Pore size distribution • Pore size stabilities • Femtopore sequencing with nanoelectrodes • Sequencing feasibility with bigger pores than 2 nm • Sequence identification by conductivity and permmitivity • DNA stretching control • DNA translocation control 500nm channel

38. 사업화 전략 매출성장 가능성: 초/중/장기 아이템과 시장 점유 전망

39. SUMMARY Nanofabrication is the key for nano-science. Femtosecond laser pulses has allowed 3D nanomachining. Femtofab will be a breakthrough in nanofabrication. Potential markets are also huge as well as scientific impact. Femtofab technologies are proprietary and exclusive.

40. ACKNOWLEDGEMENTS

41. PRE-FEMTOFAB: Nano-Capillary Electrophoresis (nCE) What is CE? • CE –Capillary Electrophoresis introduced in 1960s is a separation technique that separates species (analytes) by their mobility (charge-to-mass) in a capillary format. • Compared with (gel-) electrophoresis, CE achieves higher resolution, faster separation, less sample consumption, and ease of automation.

42. PRE-FEMTOFAB: Minimized thermal damage of nCE Thermal issues in the submicron-scale separation column 1. Temperature gradient to radial direction Steady-state 2. Steady-state temperature=maximum temperature rise 3. Rapid subsecond separation: transient temperature rise Transient 1. nCE is actually free from the Joule heating problem! 2. External cooling is not necessary! 3. Only the ultimate limitation, the material breakdown, limits nCE.