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第 10 章 高效液相色谱法. high performance liquid chromatogrphy HPLC. 第 10 章 高效液相色谱法. 10.1 概述 10.2 HPLC 的分类与基本原理 10.3 各类高效液相色谱法 10.4 固定相 10.5 流动相 10.6 高效液相色谱仪 10.7 定性、定量分析方法 10.8 应用与示例. 10.1 概述. 1. 基本概念与特点 2. HPLC 与经典 LC、GC 的比较 3. HPLC 仪器结构. 10.1 概述 >> 1. 基本概念与特点.
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第10章 高效液相色谱法 high performance liquid chromatogrphy HPLC
第10章 高效液相色谱法 10.1 概述 10.2 HPLC的分类与基本原理 10.3 各类高效液相色谱法 10.4 固定相 10.5 流动相 10.6 高效液相色谱仪 10.7 定性、定量分析方法 10.8 应用与示例
10.1概述 1. 基本概念与特点 2. HPLC与经典LC、GC的比较 3. HPLC仪器结构
10.1概述>>1.基本概念与特点 • 概念：高效液相色谱法(HPLC)是在20世纪60年代末，以经典液相色谱为基础，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高效固定相、高压输液系统和高灵敏度的在线检测器，从而发展起来的一种新型分离分析技术。随着科学和技术的不断改进与发展，目前已成为应用极为重要、广泛的分离分析手段. • 特点：分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动化。
10.1概述>>2.HLPC与经典液相色谱和气相的比较 • 高效液相色谱与经典液相色谱比较
10.1概述>>2.HLPC与经典液相色谱和气相的比较 • 高效液相色谱与气相色谱比较
注射器 进样器 高压泵 混合室 溶剂 预柱 接头 色谱柱 检测器 数据系统 图10－1 HPLC仪器结构图 10.1概述>>3.HPLC仪器结构
10.2 HPLC的分类与基本原理 10.2.1 高效液相色谱法的分类 10.2.2 基本原理 • 化合物的极性、电荷、分子大小、旋光性四种主要的性质可以用来产生高效液相色谱分离。
液液色谱法LLC 按固定 相分类 液固色谱法LSC 分配色谱法 HPLC 吸附色谱法 离子交换色谱法 按分离 机理分类 分子排阻色谱法 化学键合色谱法 亲合色谱法 胶束色谱法 10.2 HPLC的分类与基本原理>>10.2.1高效液相色谱法的分类
1 液－固吸附色谱法LSC 2 液－液分配色谱法 LLC 3 化学键合色谱法 BPC 4 离子交换色谱法IEC 5 空间排阻色谱法 SEC 6 亲合色谱法 AC 7 胶束色谱法 MC 8 手性色谱法 CC 9 毛细管电泳色谱法 CE 正相～NLLC 反相～RLLC 正相～NBPC 反相～RBPC 一般～IEC 离子色谱法IC 氨基酸色谱法AA 凝胶渗透色谱法GPC 凝胶过滤色谱法GFC 开管～OTCEC 填充～PCEC 一般～RBPC 离子对色谱法PIC 离子抑制色谱法ISC HPLC 胶束～MEKC 壁处理～CEC 键合相～CEC 毛细管凝胶～CGE 详细分类图
10.2 HPLC的分类与基本原理>>10.2.2 基本原理 • HPLC与经典LC和GC在基本原理、概念和方法基本上相同，主要差别是流动相的性质不同。因此，某些公式的表现形式或参数的含意有些差别。 1. Van Deemter 方程式 2. Giddings 偶合式简介
10.2 HPLC的分类与基本原理>>10.2.2 基本原理>>1. Van Deemter方程式 ⑴Van Deemter方程在气相色谱中的表现形式 ⑵Van Deemter 方程在HPLC的表现形式：H=A+Cu • 流动相为液体，组分的纵向扩散系数B很小，流速 u 较高，故纵向扩散相B/u 可以忽略。可以近似地认为H与u成线性关系，A为截距，C为斜率。
GC H 1 HPLC 2 u 3 4 5 图20－2 流动相的流速对 GC与HPLC板高影响对比 10.2 HPLC的分类与基本原理>>10.2.2 基本原理>>1. Van Deemter方程式 • 流动相的流速对GC与HPLC板高影响的差别
10.2 HPLC的分类与基本原理>>10.2.2 基本原理>>1. Van Deemter方程式 ⑶ 由H=A+Cu，讨论A项与C项对HPLC柱效的影响 涡流扩散项：A＝2λdp，可以通过①降低固定相粒径dp、②降低不规则因子λ，使A 变小柱效提高。 • 故HPLC的塔板理论高度H主要由涡流扩散项、流动相传质阻抗项和静态流动相传质阻抗项三项构成。
涡流扩散 图10－3 涡流扩散与各种传质阻抗对液相色谱峰展宽的影响 D静态流动相 传质阻抗 C流动相 传质阻抗 E固定相 传质阻抗
10.2 HPLC的分类与基本原理>>10.2.2 基本原理>>1. Van Deemter方程式 ⑷ 应用范氏方程选择HPLC的分离条件 ① 采用粒径小而均匀的球形固定相，首选化学键合相，用匀浆法装柱。 ② 采用低黏度流动相，低流量(1mL/min)，首选甲醇。 ③ 采用柱温箱，避免室温波动，增加实验重复性，柱温以25～30℃为宜。
10.2 HPLC的分类与基本原理>>10.2.2 基本原理>>2.Giddings偶合式简介 • Giddings认为：影响塔板高度的各项因素，并不都是孤立的。而且证明，涡流扩散项A与流动相传质阻抗项是偶合的（HA为偶合相）。
10.3 各类高效液相色谱法 10.3.1 吸附色谱法(LSC) 10.3.2 分配色谱法(LLC) 10.3.3 化学键合色谱法(BPC) 10.3.4 其他色谱法
10.3 各类高效液相色谱法>>10.3.1 吸附色谱法 LSC 1. 分离机理 吸附色谱法是被分离的组分分子(溶质分子)与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心，因溶质分子的吸附系数的差别而分离。 2. 影响容量因子(k)的因素 以硅胶吸附剂为例： ⑴ 硅胶与溶质分子的亲和力顺序：k大者后出峰。 kmin→饱和烃＜芳烃＜…＜酯醛酮＜…＜羧酸→kmax ⑵ 溶质的极性：常用流动相是以烷烃为底剂，加入适当的极性溶剂组成二元或多元溶剂系统，从而能调整溶解的极性，控制组分的保留时间。溶剂系统的极性越大，洗脱力越强。
10.3 各类高效液相色谱法>>10.3.2 分配色谱法(LLC) 1. 分离机理：分配色谱法是由于样品组分溶入固定相(s)与流动相(m)达到“平衡”后的分配系数的差别而分离。组分在固定相与流动相中的溶解度差别越大(K、k差别也大) 分离效果越好。 2. 正相液－液色谱法(NLLC)：流动相极性小于固定相极性的LLC称为NLLC。正相洗脱时样品中极性小的组分先流出色谱柱，极性大的组分后流出色谱柱. 3. 反相液－液色谱法(RLLC)：流动相极性大于固定相极性的LLC称为RLLC。反相洗脱时样品中极性大的组分先流出色谱柱，极性小的组分后流出色谱柱.
十八烷基硅烷 键合相ODS 硅胶表面 10.3 各类高效液相色谱法>>10.3.3 化学键合色谱法 • 化学键合相：将具有官能团的固定相键合到载体表面，构成化学键合相。 • 化学键合色谱法：以化学键合相为固定相的色谱法，简称键合色谱法(bond phase chromtography)。 • 特点：既有分配作用，又有吸附性能。
10.3 各类高效液相色谱法>>10.3.3 化学键合色谱法 • 反相键合相色谱法，RBPC • 正相键合色谱法， NBPC • 离子对色谱法，IPC or. PIC • 离子抑制色谱法，ISC • 其他色谱法
10.3 各类高效液相色谱法>>10.3.3 化学键合色谱法>>1.反相键合相色谱法 • 反相键合相色谱法 RBPC • 典型的反相键合色谱法(RBPC)，是用非极性的键合固定相和极性流动相组成的色谱体系。固定相常用十八烷基硅烷键合相(ODS或C18)；流动相常用甲醇－水、乙腈－水。 • 非典型反相键合色谱系统，用弱极性或中等极性键合相与极性大于固定相的流动相组成。
10.3 各类高效液相色谱法>>10.3.3 化学键合色谱法>>1.反相键合相色谱法 ⑴ 分离机理 反相键合相表面具有非极性烷基官能团和未被取代的硅醇级，分离机理较复杂，有疏溶剂理论、双保留机理、顶替吸附－液相相互作用模型等。 疏溶剂理论：把非极性的烷基键合相看作一层键合在硅胶表面上的十八烷基的“分子毛”，它有较强的疏水特性。如图10-4所示。 图10-4 疏水剂缔合示意图
10.3 各类高效液相色谱法>>10.3.3 化学键合色谱法>>1.反相键合相色谱法 • 当用极性溶剂为流动相来分离含有极性官能团的有机化合物时，一方面分子中的非极性部分与固定相表面上的疏水烷基产生缔合作用，使它保留在固定相中；另方面被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，促使它离开固定相，并减小其保留作用。结果两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。 图20-4 疏水剂缔合示意图
10.3 各类高效液相色谱法>>10.3.3 化学键合色谱法>>1.反相键合相色谱法 ⑵ 流动相的极性与容量因子的关系 流动相极性增大，洗脱能力降低，溶质的k增大，tR增大；反之，k减小，tR也减小。作反相洗脱时，对于结构相近的组分，极性大的组分先出峰。
10.3 各类高效液相色谱法>>10.3.3 化学键合色谱法>>2.正相键合色谱法 • 正相键合色谱法(NBPC)：固定相一般以氰基或氨基等极性基团作为键合相；流动相以烷烃(正己烷)中加入适量的极性调整剂(如氯仿、甲醇、乙腈等)为流动相。用途主要用于分离极性不同的化合物、异构体，特别适用于分离不同类型的化合物。 ⑴ 分离机理 主要靠组分分子与固定相之间的范德华力、氢键作用力的差别而进行分离。 ⑵ 流动相的极性与容量因子的关系 作正相洗脱时，流动相的极性增大，洗脱能力增加，k减小， tR减小；反之，k 与tR增大。分离结构相近的组分时，极性大的组分后出峰。
10.3 各类高效液相色谱法>>10.3.3 化学键合色谱法>>3.离子对色谱法 • 离子对色谱(ion pair chormatography，IPC) 在流动相中加入与被测离子相反电荷的离子对试剂，使之形成中性的离子对化合物，从而增加样品离子在非极性固定相中的溶解度，使分配系数增加，分离改善。分配系数的大小主要取决于离子对化合物的解离平衡常数和离子对试剂的浓度。 ⑴ 常用离子对试剂 分离碱类：用烷基磺酸盐为离子对试剂。如十二烷基磺酸钠，正戊/己/庚/辛磺酸钠(PIC-B5/6/7/8)等。 分离酸类：用四丁基季铵盐(PIC-A) ，如四丁基胺磷酸盐(TBA)等。
流动相 固定相 10.3 各类高效液相色谱法>>10.3.3 化学键合色谱法>>3.离子对色谱法 ⑵ 分离机理以RPIC分离碱类物质为例，用离子对模式说明分离机理 ⑶ 分配系数 ⑷ 主要用途 有机酸碱盐的分离，避免流动相(酸碱)对泵和流路的腐蚀；药物分析，如生物碱、有机酸、磺胺类药物、某些抗生素和维生素，体内药物分析等。缺点是价格昂贵。
10.3 各类高效液相色谱法>>10.3.3 化学键合色谱法>>4.离子抑制色谱法 • 在反相色谱法中，通过调节流动相的pH值，抑制样品组分的解离，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸、弱碱的目的，这种技术称为离子抑制色谱法。 ⑴ 适用范围 适用于3.0≤pKa≤7.0弱酸；7.0≤pKa≤8.0弱碱。 ⑵ 抑制剂 流动相中加入少量的弱酸、弱碱或缓冲溶液为抑制剂(常用乙酸、氨水、磷酸盐、乙酸盐)。
10.3 各类高效液相色谱法>>10.3.3 化学键合色谱法>>4.离子抑制色谱法 ⑶ 影响容量因子的因素 对于弱酸，当流动相pH＜pKa时，组分以分子形式为主，k值增大，tR增大；反之，组分以离子形式为主，k值变小，tR减小。 对于弱碱，以上两种情况正好相反。 ⑷ 用途 可用于有机弱酸、弱碱与两性化合物的分离，以及它们与分子型化合物共存时的分离。 不适用于pKa＜3的酸、 pKa＞8的碱，这些可采用离子对色谱法、离子交换色谱法进行分离。
10.3 各类高效液相色谱法>>10.3.5 其他色谱法(阅读) • 离子色谱法 • 手性色谱法 • 环糊精色谱法 • 胶束色谱法 • 亲和色谱
10.3 各类高效液相色谱法>>10.3.6 分离类型的选择>>1.根据相对分子质量选择 1.根据相对分子质量选择 2. 根据溶解度选择 3. 根据分子结构选择 • 相对分子质量十分低的样品，其挥发性好，适用于气相色谱。标准液相色谱类型(液-固、液-液、及离子交换色谱)最适合的相对分子质量范围是200～2000。对于相对分子质量大于2000的样品，则用尺寸排阻法为最佳。
10.3 各类高效液相色谱法>>10.3.6 分离类型的选择>>2.根据溶解度选择 • 弄清样品在水、异辛烷、异丙醇、苯、四氯化碳中的溶解度是很有用的。 ⑴ 如果样品可溶于水并属于能离解物质，以采用离子交换色谱为佳； ⑵ 如样品可溶于烃类(如苯或异辛烷)，则可采用液-固吸附色谱； ⑶ 如果样品溶解于四氯化碳，则多采用常规的分配和吸附色谱分离； ⑷ 如果样品既溶于水又溶于异丙醇时，常用水和异丙醇的混合液作液-液分配色谱的流动相，以憎水性化合物作固定相。
10.3 各类高效液相色谱法>>10.3.6 分离类型的选择>>3.根据分子结构选择 • 用红外光谱法，可预先简单地判断样品中存在什么官能团。然后，确定采用什么方法合适。 • 例如：酸、碱化合物用离子交换色谱；脂肪族或芳香族用液-液分配色谱、液-固吸附色谱；异构体用液-固吸附色谱；同系物不同官能团及强氢键的用液-液分配色谱。
相对分子 质量＞2000 溶于水 排阻色谱，水为流动相 不溶于水 排阻色谱，非水流动相 同系物——分配色谱 异构体——吸附色谱 分子大小差异——排阻色谱 样品 不溶于水 相对分子 质量＜2000 反相液一液色谱 排阻色谱，水为流动相 不离解 碱——阳离子交换色谱 酸——阴离子交换色谱 溶于水 可离解 离子与 非离子 反相离子对色谱 液相色谱分离类型选择参考表
10.4 固定相 10.4.1 液－固色谱固定相 10.4.2 化学键合相 10.4.3 其他固定相
10.4 固定相>>10.4.1 液－固色谱固定相 1.硅胶 ⑴无定形多孔硅胶，国产代号YWG，dp5~10μm ⑵球形全多孔硅胶，国产代号YQG ，dp3~10μm ⑶堆积硅珠，国产代号YQG ，dp3~5μm 2.氧化铝 ⑴球形(5～10μm)；⑵无定形(5～10μm)。 3.高分子微孔多球(有机胶) ⑴国产YSG系列；⑵日立3010胶等。 4.其它 ⑴分子筛；⑵聚酰胺等。
10.4 固定相>>10.4.2化学键合相 • 用化学反应的方法将固定液的官能团键合在载体(硅胶)表面上，所形成的固定相，称为化学键合相。具有分配和吸附作用。优点： ①使用过程不易流失； ②化学性质稳定，在pH2~8的溶液不变质； ③热稳定性好，一般在70℃以下稳定； ④载样量大，比硅胶高约一个数量级； ⑤适于作梯度洗脱。
10.4 固定相>>10.4.2化学键合相 • 化学键合相一般用硅胶作载体，具有分配作用和一定的吸附作用。吸附作用的大小视键合覆盖率而定。用化学反应方法将载体表面上残存的硅醇基除去，称为封尾(封顶或遮盖)，所形成的键合相称为封尾键合相，完全封尾的键合相无吸附作用，缺点是疏水强。 • 按极性分类：非极性、中等极性、极性键合相3类
10.4 固定相>>10.4.2化学键合相 1. 非极性键合相：十八烷基硅烷键合相(ODS)是最常用的非极性键合相。 2. 中等极性键合相：常见的有醚基键合相。 3. 极性键合相：强极性－氨基键合相(分析糖类)；中强极性－氰基键合相。
10.4 固定相>>10.4.3其他固定相 1. 离子交换剂 2. 凝胶 3. 手性固定相 4. 亲合色谱固定相
10.5 流动相(溶剂系统) 10.5.1 分离方程式 10.5.2 Snyder溶剂分类 10.5.3 正相洗脱与反相洗脱 10.5.4 洗脱方式 10.5.5 流动相溶剂的选择
10.5 流动相(溶剂系统)>>10.5.1分离方程式 • 依据分离方程式讨论溶剂系统对分离度的影响 • 分离度受三项因素左右：a项由色谱柱的质量决定；b、c两项由流动相决定。分配系数比α与容量因子k虽然相互关联，但溶剂的种类主要改变α。这是因为溶剂的种类不同，分子间的作用力的性质、强度不同，选择性不同。在溶剂种类确定以后，配比的调整只是改变极性，改变洗脱能力，改变保留时间，而分子间作用力的性质不变 ，因此主要是改变容量因子k。概括为：溶剂种类主要影响分配系数比α(主要改变峰间距)，溶剂配比主要影响容量因子k(主要改变保留时间)。
10.5 流动相(溶剂系统)>>10.5.2 Snyder溶剂分类 • 组分的分配系数，由样品组分、溶剂、固定相三者间的作用力(分子间作用力)综合作用所决定(表10-2) • Snyder选用了乙醇、二氧六环、硝基甲苯3个参考物，用于检验3种分子间作用力，分别用Xe、Xd、Xn表述。测定、计算出溶剂的极性参数P′值列于表10－3。P′值大者，极性大，洗脱能力大。
10.5 流动相(溶剂系统)>>10.5.3正相洗脱与反相洗脱 1. 正相洗脱 用极性小于固定相的流动相的洗脱方式，称为正相洗脱、正相展开。适用于正相色谱法。参阅P507表18-3常用溶剂的极性参数P’与分子间作用力。P ’大，极性大，洗脱能力强。例如，水、正己烷、正戊烷的值分别为10.2、0.1、0.0，作正相洗脱时，水洗脱能力最强，正己烷和正戊烷的洗脱能力最弱。
10.5 流动相(溶剂系统)>>10.5.3正相洗脱与反相洗脱 2. 反相洗脱 在反相洗脱中，溶剂的洗脱能力用强度因子S值表示，S值大者洗脱能力大。反相色谱的首选纯溶剂为甲醇、乙腈与四氢呋喃，常以水为底剂。
10.5 流动相(溶剂系统)>>10.5.3正相洗脱与反相洗脱 3.无论正相或反相洗脱，一般均采用多元溶剂系统。
10.5 流动相(溶剂系统)>>10.5.4洗脱方式 1. 等度洗脱(isocratic elution) 用恒定配比的溶剂系统的洗脱方式，称为等度洗脱 优点：简便、重复性好、色谱柱易再生。 缺点：对于成分复杂的样品，效果欠佳。 2. 梯度洗脱(gradient elution) 梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值、离子强度相应地变化，达到提高分离效果、缩短分析时间的目的。
