PAGE 分离 LDH 同工酶

1. PAGE分离LDH同工酶 2006级七年制临床 姚沅清 2008年7月10日

2. 一：试验目的 • 了解聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyarcylamide gel electrophoresis, PAGE）的基本原理。 • 学习聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离乳酸脱氢酶同工酶及其酶活性染色法。

3. 二：实验原理 • 单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下，聚合交联成三维网状结构的凝胶支持物，起到一个分子筛的作用。 • 蛋白质为两性物质，在不同的pH下代不等的电荷，在电场力作用下而运动；其运动的速度与电荷，粒子的大小，凝胶孔胶有关，从而达到分离作用。

4. 三：仪器及试剂 • 仪器： • 电泳仪、垂直板电泳槽、电泳玻璃板、脱色摇床、20μl取样器、1ml取样器、磁力搅拌器、烧杯、台式高速离心机、白瓷盘、电炉、铝锅等。 • 试剂 ： • 分离胶缓冲贮备液（A液）： pH8.9 Tris~HCl缓冲液 • 浓缩胶缓冲贮备液（B液） ：pH6.7 Tris~HCl缓冲液 • 30％分离胶贮备液，30％浓缩胶贮备液； • 100g/L AP ，2×样品缓冲液，10×电极缓冲液 ， 1.5%琼脂糖 ，0.5mol/L pH7.5生理缓冲液盐 （PBS） ，1mol/L NaOH溶液，1 mol/L 乳酸溶液 ，1g/L溴酚蓝溶液，乳酸脱氢酶染色液5%（v/v），乙酸溶液 0.01 mol/L，pH6.5的PBS（组织匀浆用）

6. 四：实验步骤 （1）样品制备： 样品为组织匀浆上清液。取小白鼠肝、脑、心、肾、肌等组织，进行处理后，取上清备用。 （2）夹心式垂直电泳槽的安装： 如图进行安装

7. 四：实验步骤 （3）灌注分离胶 按7％凝胶配方，用50ml的烧杯称甘油，加入分离胶缓冲液、30％分离胶贮备液，蒸馏水，用磁力搅拌器混匀，在加入AP和TEMED，混匀、停止搅拌。加入组装好的电泳槽。 注意 图2 ：灌胶示意图 加蒸馏水或覆盖液于分离胶上，防止表面张力引起的边缘效应导致凝胶上面成弧形。同时在凝胶胶联时要控制pH和温度！

8. 四：实验步骤 （4） 配制、灌注浓缩胶 将梳子放在分离胶上，两块玻璃之间，将配好5％的浓缩胶应用液加入电泳槽，直至与玻璃板上沿平；聚合完成且彻底老化后轻轻拔出梳子。然后立即向样品池加入蒸馏水，随后吸出，再加入蒸馏水再吸出。同时用6号注射针整理样品池。 注意 梳子齿下缘不可有气泡，如有气泡，应想法排除。此后，如 胶面下降，随时补充，保持胶面与玻璃板上沿平。

9. 四：实验步骤 （5）加样： 用上样枪头将处理后的组织上清液及电极缓冲液加入样品槽中。 加样品及电极缓冲应缓慢加入，避免样品及电极缓冲液混合造成污染和不好的电泳结果。 注意

10. 四：实验步骤 （5）电泳 将电泳槽和电泳仪相连，上电极接负极，下电机接正极；在上电极缓冲液池中加滴加2滴溴酚蓝示踪，开始电泳。

11. 四：实验步骤 • 示踪染料线电泳到离电泳槽端0.5cm~1.0cm时，即可停止电泳，将凝胶慢慢的滑入到固定液内。 • 胶板用蒸馏水洗净后染色（37℃温度下，保温30min）。 • 染色完毕的胶板放入2% HAC中固定保存。

12. 电泳结果实例

13. 其它注意事项 • 丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺均有毒，操作时应戴手套和口罩。 • 硅胶凹槽条、样品槽梳子及玻璃板应仔细清洗，然后阴干 。 • 固定电泳槽的螺、要平均用力、以免用力不均，玻璃板破裂。 • 用琼脂糖封底，应封好、以免凝胶漏出。

14. 方法评价 • 优点： • 灵敏度高，重复性好；观察、记录和保存电泳分离的结果十分方便。 • 可多样品测定。 • 缺点： • 操作复杂。 • 实验结果受实验人员经验影响较大。 • 不能实现自动化操作。

15. 谢谢！

16. 影响聚丙烯酰胺凝聚的因素 • 聚丙烯酰胺的特性如机械特性，弹性，透明度，粘着度及孔径大小，取决于两个重要参数：两单体总百分浓度T，胶联百分浓度C。 其中a:丙烯酰胺质量(g),b:甲叉双丙烯酰胺的质量（g）,m:水或缓冲溶液的终体积（ml） T=(a+b)／m×100% C=b /(a+b)×100%