实验十四杂交瘤技术

实验十四杂交瘤技术 指导教师：唐颖生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

1. 实验目的 • 掌握杂交瘤技术的基本原理和基本操作方法。 • 能运用杂交瘤技术来制备自己所需要的单克隆抗体。生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

2. 实验原理 生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

杂交瘤技术产生的3个技术关键 • 动物免疫 • 细胞融合 • 杂交瘤细胞的筛选和克隆生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

2.1 动物免疫 （1） B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性： B淋巴细胞(B lymphocytes)：接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异性抗体，在体液免疫中具有重要功能。 B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细胞分裂，存活一段时间后便会死亡——短命细胞。生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

骨髓瘤细胞 (myeloma cells): 恶性增殖的转化细胞，只要营养条件适合可永远分裂和存活——长命细胞。经筛选与驯化，现已建立多种骨髓瘤细胞株——没有抗体分泌物。生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

2.1 动物免疫 （2）动物免疫目的：在细胞融合后获得尽可能多的分泌针对于该目标抗原的特异性抗体的杂交瘤细胞. 特定目标抗原免疫动物刺激脾脏中B淋巴细胞能分泌针对于该抗原的特异性抗体 B淋巴细胞大量增殖生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

皮下注射 腹腔注射静脉注射免疫途径：常用免疫方法： • 常规免疫法 • 脾内一次性免疫法 • 短程免疫法 • 体外免疫法 “稳妥；优势克隆” “省时；省抗原” “省时” “操作繁琐” 生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

脾细胞 (B淋巴细胞) 骨髓瘤细胞杂交瘤细胞 2.2 细胞融合分泌抗体短命长命不分泌抗体分泌抗体长命 Köhler和Milstein, 1975 生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

细胞融合方法 • 病毒介导的细胞融合 • PEG介导的细胞融合 • 电激融合生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

2.3 杂交瘤细胞的筛选和克隆 脾细胞 (B淋巴细胞) 骨髓瘤细胞杂交瘤细胞骨髓瘤细胞/ 骨髓瘤细胞脾细胞/脾细胞脾细胞骨髓瘤细胞不能长期存活不能长期存活筛选出（1）杂交瘤的筛选 B淋巴细胞： HGPRT+，TK+ 存活 HAT培养基筛选死亡骨髓瘤细胞： HGPRT-，TK-

外源性途径(旁路途径) 二氢叶酸还原酶次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶( HGPRT ) H 谷氨酰胺 or 单磷酸尿苷酸 DNA A 内源性途径(主要途径) 外源性途径(旁路途径) T 胸腺嘧啶激酶 ( TK ) 生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

（2）抗体的检测 • 要求： • 简便、快速、敏感; • 在短时间内能检测大量样品常用方法： • 酶联免疫吸附法( ELISA) • 间接免疫荧光法(IFA) • 放射免疫法(RIA) • 双相扩散法生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

有色产物 酶标仪检测底物酶第2抗体第1抗体抗原酶联免疫吸附法(ELISA) 技术原理：待检杂交瘤培养上清液生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

（3）克隆化 常用克隆化方法： • 80个细胞/96孔 • 饲养细胞有限稀释法软琼脂平板法显微操作法 ELISA法检测单克隆杂交瘤细胞的培养上清，选出分泌特异性抗体的阳性孔，所分泌抗体即为单克隆抗体。生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

高度纯一 • 高度专一单克隆抗体优点：应用： • 疾病的论断和治疗(生物导弹) • 生物大分子的鉴定、定位和分离纯化 • 细胞器的鉴定、定位和分离 • 特定细胞或病毒的鉴定、定位和分离单克隆抗体(monoclonal antibody, MAb) 由单一克隆的杂交瘤细胞分泌的抗体，只针对于一个抗原决定簇——单克隆抗体(monoclonal antibody, MAb) 生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

常用的大规模培养方法： 动物接种法转瓶培养法细胞培养罐法（4）大规模培养——批量生产单克隆抗体生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

3.实验材料、用品 • 实验材料8～12周龄BALB/c纯系小鼠10只；SP2/0-AG14骨髓瘤细胞；灭活人轮状病毒（用作抗原）。： • 实验用品 • 仪器与用具：超净工作台、普通离心机、倒置显微镜、酶联免疫检测仪、CO2恒温培养箱、恒温水浴、烤箱、高压灭菌锅。血细胞计数板、25ml和50ml培养瓶、96孔和24孔培养板各、40孔酶标板、50ml塑料离心管、10ml玻璃离心管、lml、5ml和10ml吸管、6cm培养皿、100ml和50ml培养液瓶各、1ml、5ml和10ml注射器各、小滴管、玻璃套管、手术剪刀、手术镊、6号针头、L型6号针头、500ml和1000ml烧杯、酒精灯、不锈钢网(5×5cm 200目)、解剖盘、培养液抽滤灭菌装置。生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

试剂： RPMI 1640培养基、小牛血清(FCS)、GKN液、50％PEG液、HT培养液、HAT培养液、0.5％胎酚蓝、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、包被液、底物反应液、辣根过氧化物酶—羊(或兔)抗鼠IgG、青霉素、链霉素。生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

4.实验步骤 生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

4.1 动物免疫 实验使用人轮状病毒脾内一次性免疫法来免疫动物。 • （1）纯化分离已灭活的人轮状病毒，并精确定量。 • （2）按每克体重注射0.05g戊巴比妥钠的量进行小鼠腹腔注射，对2只10周龄的BALB/c小鼠进行麻醉，5min后小鼠即进入昏迷状态。 • （3）无菌打开小鼠腹腔，暴露出脾脏，用1ml注射器将含有30µg的0.1ml人轮状病毒（抗原）液分别注射到两只小鼠脾脏内。 • （4）将脾脏轻轻复位，缝合伤口，饲养备用。 • （5）免疫三天后取脾细胞进行融合。生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

4.2 细胞悬液的制备与融合 (1) 脾细胞悬液的制备：最后一次免疫后第3天制备 (2) 骨髓瘤细胞悬液的制备：于对数生长期制备 (2) 饲养细胞悬液的制备生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

①脾细胞悬液的制备 取已免疫BALB/c小鼠，于免疫后第三天用眼球放血法处死（收集流出血液制备阳性血清），用70%酒精浸泡消毒5min后，无菌打开腹腔，取出脾脏，去除多余的脂肪组织，用37℃ GKN液清洗2～3次。向脾内注射0.2ml GKN液后（使脾脏膨胀以利于细胞散开），放人培养皿中，加入5ml GKN液，用L型6号针头将脾细胞轻轻挤出，用滴管吹打数次以使细胞散开成单细胞状态。用不锈钢网将此细胞悬液过滤到一个50ml塑料离心管中，再加入10ml GKN液，混匀后，1000 r/min离心5min，弃上清，用10ml GKN液重新悬浮细胞，取0.1ml均匀细胞悬液进行活细胞计数，其余细胞悬液放37℃备用。生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

②SP2/0-Ag14细胞悬液的制备 将SP2/0-Ag14细胞用RPMl 1640完全培养液作增殖培养，每天传代一次，连续传代三天，使细胞在融合时达到对数生长期。取3～5瓶(50ml的培养瓶)SP2/0-Ag14细胞，倾去原来的培养上清液，每瓶加入37℃ GKN液4ml，将细胞悬浮起来，收集各瓶中细胞液放人一个50ml塑料离心管中，1000r/min离心5min，弃去上清液，用10ml 37℃ GKN液将细胞悬浮均匀，取0.1ml作活细胞计数，其余悬液放37℃备用。生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

③腹腔巨噬细胞悬液的制备 杂交瘤细胞开始生长时，需要有饲养细胞，一般用腹腔巨噬细胞作为饲养细胞。取12周龄BALB/c小鼠，拉颈处死，浸入70%酒精中消毒5min。在解剖盘中无菌打开腹部皮肤，暴露出腹膜，向腹腔中注入10ml RPMI 1640完全培养液，按摩腹部1～2min后，用注射器抽出腹腔液（一般可抽出8—9ml），放人一个50ml塑料离心管中，置37℃备用。一般一只小鼠取出的腹腔巨噬细胞可接种3～5块24孔或96孔培养板。可根据需接种的培养板数来确定所使用饲养细胞的量。生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

4.3 细胞融合及HAT筛选 融合后细胞混合液 HAT培养基 2 weeks later HT培养基 1 week later 正常培养基生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

①将已计数脾细胞和SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞按6:1的数量比例混合于一个50ml塑料离心管中，1000 r/min离心10min。 • ②弃上清液，轻弹离心管底部，使沉淀细胞松散，放40℃预热1～2min。 • ③向已预热的离心管中边摇边在45s内匀速加入1ml 50%PEG溶液。 • ④立即在90s内边摇边向管内加速加入15ml 37℃ GKN液，放室温静置10min。 • ⑤1000r/min离心10min，弃上清。生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

⑥向离心管中加入37℃腹腔巨噬细胞悬液和40ml 37℃的HAT培养液，悬浮均匀。 • ⑦将细胞悬液分别接种于二块24孔板（0.5ml/孔）和二块96孔板（0.2ml/孔）中，放37℃ 5%CO2 培养箱中培养。 • ⑧每天观察细胞的生长情况。 • ⑨于融合后第5天，用HAT培养液半量换液；于第10天用HT培养液半量换液；于第14天用HT培养液全量换液。 • ⑩当杂交瘤细胞长满孔底面积的1/2—2/3时，即可取培养上清液进行抗体检测。生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

4.4 抗体的检测 • a 将纯人轮状病毒用包被液稀释，使该病毒浓度为10µg/100µl。 • b 将此浓度抗原液按每孔100µl的量分别加入40孔酶标板孔中，轻轻震荡使液体覆盖孔底。 • c 把酶标板放在4℃冰箱过夜（或37℃孵育1～2h）。 • d 取出包被好的酶标板，倾去其中液体，用PBSS-T20缓冲液洗涤酶标板孔，每次洗3min，共洗3次。 • e 每孔加入含1%小牛血清白蛋白(BSA)的PBSS-T20缓冲液至孔满，室温下封闭30min。 • f 甩去封闭液，用PBSS-T20缓冲液洗3次，每次3min。生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

g 每孔加入待测杂交瘤培养上清液100µl。留出4孔加入100µl阳性血清作为阳性对照，4孔加入HT培养液100µl作为阴性对照，4孔加入PBSS-T20缓冲液100µl作为空白对照。 • h 在37℃恒温恒湿水浴中放置60～90min。 • i 甩去待测上清液及对照液，用PBSS-T20液洗5次，每次3min。 • j 每孔加入100µl按1:500倍稀释的标有辣根过氧化物酶的羊（或兔）抗鼠IgG，37℃孵育60min。 • k 甩去酶标二抗液，用PBSS-T20液洗5次，每次3min。 • l 每孔加入100µl邻苯二胺底物反应液，室温暗处反应30min。 • m 每孔加入1滴2mol/L H2SO4终止反应，用酶联免疫检测仪进行结果检测。呈现棕褐色反应者为阳性反应。检测出上清液为阳性的培养板孔即为阳性孔，可进行克隆化实验。生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

B淋巴细胞 瘤的突变株动物免疫 X抗原 BALB/c 培养上清中X抗体的检测克隆化培养分泌X抗体 B淋巴细胞骨髓瘤细胞无限生长细胞培养数天后细胞死亡单克隆杂交瘤细胞培养上清中X抗体的检测细胞融合混合细胞的HAT筛选) 杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体只有杂交瘤细胞可长期存活下来分泌 X抗体规模化培养获得大量单克隆抗体杂交瘤技术操作流程图解

5.实验结果 生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

（1）免疫效果的观察 在细胞融合前取出脾脏时，如果脾脏比正常状态明显膨大，则说明有免疫效果，用此脾脏的脾细胞进行细胞融合成功的可能性较大；如果脾脏无明显膨大则说明免疫效果不佳，可及时终止实验，以免浪费人力物力而一无所获。生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

（2）融合结果的观察 • 细胞融合后，将培养板置倒置显微镜下观察，则可看到各种类型的细胞，有未融合的脾细胞和SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞，也有融合细胞。在融合细胞中，有的已完成融合过程，变成了融合细胞，有的仍然呈哑铃形，在高倍镜下仔细观察即可分辨出细胞中有两个核，可以计算一下融合率来判定融合效果。 • 在融合后第3～5天，便可看到SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞大量死亡。死亡细胞逐渐变得不透明，最终解体，丧失贴壁性，从孔底脱落，经换液可清除部分死亡细胞以免影响活细胞的生长。培养孔中较大的透亮细胞为杂交瘤细胞。脾细胞较小，于融合后第14天左右大量死亡，经换液可去除部分死亡细胞以减少对活细胞的毒害作用。 • 在融合后第5天左右便有杂交瘤细胞开始分裂，从而出现一些较小的细胞克隆，一个培养孔往往会出现多个细胞克隆。生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

（3）克隆化结果的观察 在克隆化后第5天左右即可看到小的细胞克隆，检查培养板并标出含有单个细胞克隆的培养孔。单细胞克隆的外形应为圆形，形状非圆形的细胞团则可能不是单细胞克隆。生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

6.思考题 • 细胞融合后，各种类型的细胞在倒置显微镜下形态如何? • 为什么要进杂交瘤细胞的克隆化培养? • 单细胞克隆有何形态特征?如何判定一个细胞团是不是单克隆细胞? 生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

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